实验方法原理弹力纤维由随机交联盘绕的一些肽链组成，含有丰富的二硫键糖蛋白成分，所以可称为弹性蛋白。易与染色液中碱基结合，为了能够更好地显示弹力纤维和胶原纤维成分，选用维多利亚蓝、丽春红和苦味酸组合双重染色方法。实验材料石蜡组织切片试剂、试剂盒维多利亚蓝 糊精 间苯二酚 蒸馏水 乙醇 三氯化铁水溶液 浓盐酸 苯酚二甲苯 中性树胶仪器、耗材60 ℃恒温箱 滤纸实验步骤维多利亚蓝染色液：维多利亚蓝（Victoria blue）2 g，糊精 0.5 g，间苯二酚 4 g，蒸馏水 200 ml。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约 5min。然后用另一容器取 30％ 三氯化铁水溶液 25 ml，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中，继续煮沸 3 min，不断搅拌溶液呈胶冻状。去火，冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸一起放在 60℃ 恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再将其溶于 400 ml 的 70％ 乙醇液中。然后加浓盐酸 4 ml 和苯酚 5 g，放置至成熟后使用。  1. 石蜡组织切片，常规脱蜡至水。 2. 切片入 70％ 乙醇中洗 2 min。 3. 将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染 2～5 h。 4. 直接入 95％ 乙醇中分色数秒钟。 5. 用蒸馏水洗 2 min。 6. 用丽春红-苦味酸染色液滴染切片 3 min。 7. 直接用无水乙醇冲洗多余染色液 2 次。 8. 二甲苯透明和中性树胶封固。注意事项 1. 维多利亚蓝染色液可在室温中存放较长时间，染色液浸染后倒回原处，可反复使用。 2. 95％ 乙醇分色后，立即浸入水中，可用显微镜观察染色程度，如果较浅或较深，可再重复染色或分色。其他结果：弹力纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈黄色。 

　　一、标准品和对照品的概念　　　　对照品指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质。　　　　标准品指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。　　　　国家标准品及生物参考品系指用于鉴别、检查含量或效价测定的标准物质，其制备与标定应符合:“生物制品国家标准物质制备和标定规程”要求，并由国务院药品监督管理部门指定的机构分发。企业工作标准品或参考品必须经国家标准品或参考品标化后方能使用。　　　　对照品系指用于生物制品理化等方面测定的特定物质，由生产单位采用与制品生产工艺相同的方法制备。对照品应尽可能与制品原液配方一致，稳定性较差的，可加不含对测定有干扰物质的适宜稳定剂。对照品由国家药品检定机构审查认可，其标准应不低于制品的质量标准。　　　　国家药品标准物质是国家药品标准的物质基础，它是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具;是测量药品质量的基准;也是做为校正测试仪器与方法的物质标准;在药品检验中，它是确定药品真伪优劣的对照，是控制药品质量必不可少的工具。目前，中国药品生物制品检定所已能提供各类国家标准物质1242种，其中中药化学对照品288种，对照药材400种，两者占总数的一半以上。国家药品标准品、对照品系指国家药品标准中用于鉴别、检查、含量测定、杂质和有关物质检查等标准物质，它是国家药品标准不可分割的组成部分。　　　　二、标准品、对照品种类　　　　生物制品标准物质分为二类：　　　　1、国家生物标准品　　　　系指用国际标准品标定的，或我国自行研制的(尚无国际生物标准品者)用于定量测定某一制品效价或毒性的标准物质，其生物活性以国际单位(IU)或以单位(U)表示。　　　　2、国家生物参考品　　　　国家生物参考品系指用国际参考品标定的，或我国自行研制的(尚无国际参考品者)用于微生物(或其产物)的定性鉴定或疾病诊断的生物试剂、生物材料或特异性抗血清;或指用于定量检测某些制品的生物效价的参考物质，如用于麻疹活疫苗滴度或类毒素絮状单位测定的参考品，其效价以特定活性单位表示，不以(IU)表示。　　　　三、如何区分对照品与标准品　　　　对照品与标准品是2个不同的概念，中国药典凡例中已有明确的定义：　　　　对照品系指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，而标准品系指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。　　　　文献中常将2种概念混淆，认为对照品就是标准品，是1种物质2种提法而已，造成错误的原因，可能是有的药品既有对照品，又有标准品。例如当用微生物法测定头孢克罗效价时，用头孢克罗标准品，用高效液相色谱仪HPLC或紫外分光光度计UV法测定时，则用对照品;非那西丁当用作熔点校准物质时，用熔点标准品，测定含量时用对照品。即使是同一种物质的标准品和对照品，它们的规格、标定方法以及用途都可能是不同的。　　　　对照品或标准品混用，即将对照品或标准品用于不是其标定方法的含量测定，是药品检验中经常出现但未引起重视的一个问题。尽管同一批对照品不同标定方法的含量有很好的相关性，但并不完全相同，有时差别会很大。如英国Glaxo公司提供的头孢呋肟酯对照品，HPLC标定为96.9%，供含量测定用;UV为98.8%，供溶出度测定。虽然中国药典凡例明确规定卫生部所发对照品仅用于正文中所规定的分析方法。但由于：　　　　(1)卫生部提供的对照品使用说明书不够详尽，大多无对照品质量要求及标定方法;　　　　(2)对对照品或标准品的正确使用缺乏认识;　　　　(3)日常科研中极难找到相应的对照品;　　　　(4)中国药典正文中也常存在对照品混用的问题，如常将含量测定用的标准品或对照品用于溶出度检查，而含量测定方法与溶出度分析方法又不同，故极易引起混用。　　　　引申阅读：标准品、对照品、校准品、质控品及参考品的区别　　　　标准品：是指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质，用于生物测定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质，按效价单位或以g计，以国际标准品进行标定。　　　　对照品：是指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质，除另有规定外，均按干燥品(或无水物)进行计算后使用。　　　　校准品：即校准物，具有在校准函数中用作独立变量值的参考物质;应具有定值和已知的测量不确定度，其目的应是校准某一测量系统，从而建立此系统测量结果的计量学溯源性。　　　　质控品：用于体外诊断的质量控制物质(定值和非定值)，是一种旨在用于医学用途的检测系统中使用的物质、材料、物品或设备，其目的是评价或验证测量精密度、测量准确度、由于试剂或分析仪器的变化检测系统可能产生的分析偏差等性能特征。质量控制物质(定值和非定值)，可用于能力验证、实验室内质量控制。　　　　定值质控品：定值质控品有制造商使用合适的分析方法或过程分析的参考值，并指定参考范围;　　　　非定值质控品：非定值质控品可以在标贴上标示目标浓度(如：低、高、中)，但是没有指定的参考范围，可以不用指定非定值质控品应用的分析测试系统，但需满足质量控制的系统规则。　　　　参考品：即参考物质，具有一种或多种足够均匀和很好地确定了的特性，用以校准测量装置、评级测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。

实验原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。实验仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）实验试剂：1640培养基或DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hank′s液、碘酒、75%酒精实验步骤：一、原代细胞培养步骤1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3、处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2-3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30-60分钟。4、剪切：用眼科剪把组织切成2-3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30-50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。5、消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500-1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2-7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。8、培养：置于37℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。二、原代组织块培养法1、剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm块为止。2、摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20-30块。3、轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置37℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。4、培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。三、贴壁细胞传代的操作步骤：1、吸除培养瓶内旧培养液。2、向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。3、置温箱中2-5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。4、吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。5、用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。6、计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。四、悬浮型细胞传代1、吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。2、吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。注意事项1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5、瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。6、 吸溶液的吸管等不能混用。

当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活，使电泳结果复杂化，影响zui终结果分析。为了避免这些情况的出现，建议在样品制备时尽可能在低 温下进行。此外，许多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持 着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。因此对于我们想要研究的蛋白来说，选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。 蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样，都是纷繁复杂的，通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂，如 PMSF 和 leupeptin 。而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂，如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”，见下表（来 自《蛋白质电泳实验技术》）。蛋白酶抑制剂有效抑制的酶PMSF ( Pheylmethylsulfonyl fluoride )是很常见的抑制剂，使用浓度为 1mmol/L不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为 4mmol/LAEBSF 的抑制活性与 PMSF 相近，但它更易溶于水而且毒性低EDTA，EGTA，使用浓度为 1mmol/L通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂，使用浓度为 2-20ug/ml亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶TLCk，TPCK，使用浓度为 0.1-0.5mmol/L不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶苄脒（Benzamidine）使用浓度为 1-3mmol/L抑制丝氨酸蛋白酶蛋白酶的功能和分类蛋白酶功能 :涉及到许多细胞内和细胞外的过程:1.食物蛋白在消化道的消化2.激活无活性酶原和多肽激素/神经转移介质的释放3.调节血凝物质和纤维素4.内源性和外源性蛋白的细胞内消化5.跨膜的蛋白转移6.微生物对生物体攻击,通过释放蛋白酶导致毒性的增加蛋白酶分类 :根据催化中心结构的不同蛋白酶可分为4类:1.丝氨酸蛋白酶在其活性中心含有丝氨酸和组氨酸，如:糜蛋白酶, 弹性蛋白酶，血纤维蛋白溶酶，凝血酶，枯草杆菌蛋白酶，胰酶 Chymotrypsin, Elastase, Plasmin, Subtilisin, Thrombin, Trypsin2.半胱氨酸蛋白酶（别名:硫醇或 SH 蛋白酶）在其催化中心含有半胱氨酸，如: Calpain, 组织蛋白酶 B,C 和 L，和木瓜蛋白酶3.天(门)冬氨酸蛋白酶（羧基蛋白酶）在其活化中心含有天(门)冬氨酸，如: 组织蛋白酶 D, 木瓜蛋白酶, 肾素4.金属蛋白酶含有金属离子，即: 锌2+在其催化中心，如氨基肽酶，羧基蛋白酶 A 和 B 嗜热菌蛋白酶 在分离蛋白时，组织或细胞裂解液中充满了来自溶酶体的酶,并且原来无活性的蛋白酶原被充分激活,开始消化其周围的蛋白质。为避免此因素，蛋白酶抑制剂必须被 加入在缓冲液内以阻止蛋白酶对细胞组织的消化作用。来自哺乳类动物，植物，霉菌或细菌的组织，蛋白酶成分是不同的,并根据机体状态的发展蛋白酶也可以发生变化。哺乳类动物组织分离时比细菌或其它组织分离时更需要应用蛋白酶抑制剂使组织细胞受到完全的保护。

　　试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标之一，但不能反映试剂质量的全部。试剂成份、纯度、用量及稳定性，才是保证试剂质量的关键所在。目前市售的一些试剂具有抗干扰作用，主要是通过加入抗干扰物质或使用新的色素原以避免内源性物质的干扰。但值得注意的是：一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。　　　　1、试剂空白　　　　试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标之一。每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。碱性磷酸酶、r一谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应，在放置过程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。原则上，吸光度上升的反应，其试剂空白吸光度越低越好，不能超过一个高限；相反，吸光度下降的反应，其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因此，试剂空白吸光度限值，常作为程序参数输入仪器，如经核查超限，仪器会自动报警，提示更换试剂。需要指出的是，还原型辅酶I(或II)等投料量不足或劣质的原料，往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，凑合过试剂空白核对的“关”，其后果为如下情况：　　　　1．1 线性范围变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量不足；试剂成份稳定性较差。　　　　1．2 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定结果有严重系统误差。原因：试剂底物浓度不足。　　　　1．3 低值偏高 现象：试剂空白的变化曲线(吸光度VS时间)明显波动。原因：试剂自身不稳定，自行分解；工具酶纯度不够，杂酶含量超限，导致干扰作用。　　　　2、样品信息　　　　样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定结果产生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测模式，并在结果计算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。　　　　3、测定范围　　　　每种待测物都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示结果超过范围的提示。表示试剂已经变质，应更换合格试剂。　　　　4、底物耗尽　　　　使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性非常高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超过某一吸光度变化范围，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。　　　　5、酶的预活化　　　　测定血清中的某些酶，如CK，离体(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基(一SH)被氧化造成的。只有通过适当的还原作用才能重新激活。如CK—NAC试剂盒即含有CK活化剂，名为N一乙酰半胱氨酸。实验研究证明，NAC对血清中已失活的CK活化过程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时间较长的理论依据。在AST，ALT采用IFCC推荐方法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的结果要高些。 

　　一、重组蛋白质的诱导表达　　　　1.挑取转化有质粒的单菌落，接种于 3ml 选择性 LB 液体培养基中，37 oC，250rpm/min 振摇培养过夜。　　　　2. 次日将培养过夜的菌液 500 μl 再接种于 10 ml（1:::20）选择性 LB 液体培养基中，37 oC，250 rpm/min 振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取 1 ml 样本作为诱导前标本，10000g 离心 1 min 收集菌体沉淀，－20 oC 冻存备用。　　　　3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中，使 IPTG 终浓度为 1 mM，37 oC，250 rpm/min振摇培养 4～5 小时。取 1 ml 样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20 oC 冻存备用。　　　　4. 将诱导前后菌体沉淀用 20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重悬，加入等体积的 2×SDS上样缓冲液，煮沸加热 5 min，SDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离 ，考马斯亮蓝染色 3 小时后，脱色观察结果。　　　　5. 选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20 oC 保 存 ，准备做下一步分析及纯化。　　　　二、重组蛋白质的分离纯化　　　　重组蛋白质的可溶性鉴定　　　　1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中，然后在－80 oC 低温冰箱中放置 10 min。　　　　2. 冰中解冻。　　　　3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次，每次 10 sec，间歇 10 sec，电压 200-300 V。　　　　4. 10000g，4oC，离心 20 min，取上清（为溶液 A）， －20 oC 保存；另将沉淀用同样裂解液 1 溶解（为溶液 B），同样－20 oC 保存，供后继分析使用。　　　　5. 将上述 A、B 溶液和诱导前后的细菌进行 SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色，比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于 A 溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在 B 溶液中，则为非可溶蛋白。　　　　重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化　　　　1.将菌体沉淀溶于适量裂解液 2（Lysis buffer under denaturing conditions ）中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。　　　　2. 10000g，4 oC，离心 30 min，收集上清液。　　　　3. 将 Ni-NTA Agarose 充填柱子，并连接于 Pharmarcia 低压液相层析系统，用 5倍柱体积的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose，调节 A280 值至零线。　　　　4.将适量上清液上样到 Ni-NTA Agarose 柱子中，并用 lysis buffer 冲洗至 A280值低于 0.01。　　　　5. 分别用 5～10 倍柱体积的清洗液 1 和清洗液 2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至 A280 值低于 0.01。　　　　6. 用洗脱液（Elution buffer）洗脱重组蛋白质，在 A280 值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。　　　　三、重组蛋白质的复性、冻干和定量　　　　纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用 0.01×PBS 透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用 BIO-RAD 公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。

　　细胞免疫荧光（Immunofluorescence, IF）是一种常用的技术，用于检测细胞内特定蛋白质或其他分子的分布和表达情况。分析细胞免疫荧光的结果涉及多个步骤，包括图像采集、图像处理、定量分析和数据解释。以下是详细的步骤和方法：　　　　1. 图像采集　　　　显微镜选择：使用荧光显微镜（如共聚焦显微镜）进行图像采集。共聚焦显微镜可以提供高分辨率和高对比度的图像。　　　　荧光染料选择：根据目标蛋白选择合适的荧光染料，如FITC、TRITC、DAPI等。　　　　参数设置：设定合适的激发波长、曝光时间和增益参数，以获得最佳的信号强度和对比度。　　　　多通道图像采集：如果需要检测多个目标，可以进行多通道图像采集，以区分不同荧光染料的信号。　　　　2. 图像处理　　　　背景校正：使用图像处理软件（如ImageJ、Fiji等）进行背景校正，减少非特异性荧光信号的干扰。　　　　去噪处理：应用去噪算法（如高斯滤波）减少图像噪声，提高信噪比。　　　　对比度调整：调整图像对比度，以便更清楚地观察目标信号。　　　　3. 定量分析　　　　荧光强度测定：在图像处理软件中，选定感兴趣区域（Region of Interest, ROI），测量荧光强度。可以统计多个细胞的荧光强度，计算平均值和标准差。　　　　共定位分析：如果检测多种蛋白质，可以进行共定位分析，计算不同荧光信号的重叠系数（如Pearson相关系数），以评估蛋白质的共定位情况。　　　　细胞计数：统计不同荧光信号阳性细胞的数量，计算阳性细胞比例。　　　　4. 数据解释　　　　定量结果：分析荧光强度、共定位情况和阳性细胞比例等定量数据。将这些数据与对照组进行比较，以评估实验处理的效果。　　　　空间分布：观察蛋白质在细胞内的空间分布，如是否集中在某些细胞器（如细胞核、线粒体等）或特定区域。　　　　时间变化：如果进行时间序列实验，可以分析蛋白质在不同时间点的动态变化。　　　　注意事项　　　　对照实验：包括阴性对照（无一抗）和阳性对照（已知表达目标蛋白的样本），以验证实验结果的特异性和可靠性。　　　　重复实验：至少进行三次独立重复实验，确保结果的可重复性和统计显著性。　　　　数据统计：使用适当的统计方法（如t检验、ANOVA）对定量结果进行统计分析，评估数据的显著性。　　　　总结　　　　通过细胞免疫荧光技术，可以获得关于蛋白质在细胞内的分布和表达情况的详细信息。正确的图像采集、处理、定量分析和数据解释是确保实验结果可靠性和准确性的关键。结合对照实验和适当的统计分析，可以得出具有生物学意义的结论。

根据细胞类型和特性选择合适的细胞保护剂可以考虑以下几个方面：细胞的来源和种类：原代细胞通常比细胞系更脆弱，可能需要更温和的保护剂或更高浓度的保护剂。不同组织来源的细胞，如神经细胞、心肌细胞、肝细胞等，由于其特殊的生理功能和结构，对保护剂的需求可能不同。细胞的大小和膜特性：较大的细胞可能更容易受到冰晶损伤，需要更有效的保护剂。细胞膜通透性不同的细胞对某些保护剂的摄取和耐受程度也会有所差异。细胞的代谢活性和增殖能力：代谢活跃、增殖迅速的细胞可能对保护剂的毒性更敏感，需要选择毒性较小的保护剂。细胞对渗透压的耐受性：某些保护剂可能会显著改变培养基的渗透压，对于渗透压敏感的细胞，需要选择影响较小的保护剂。细胞的分化状态：未分化细胞和已分化细胞在抗冻能力和对保护剂的反应上可能不同。例如：对于大多数哺乳动物细胞，二甲基亚砜（DMSO）是常见且有效的保护剂。胚胎干细胞和造血干细胞有时使用血清或血清替代品结合 DMSO 来提高保护效果。神经元细胞由于其特殊的结构和功能，可能更适合使用海藻糖或甘油作为保护剂。在实际选择时，通常需要进行小规模的预实验，比较不同保护剂在不同浓度下对细胞的存活、功能和形态等方面的影响，以确定最适合的细胞保护剂。

　　一、实验原理　　　　真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。　　　　蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。　　　　二、仪器及试剂　　　　1. 仪器：　　　　恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）　　　　2. 试剂：　　　　（1）细胞裂解缓冲液：　　　　Tris (pH8.0) 100 mmol/L　　　　EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L　　　　NaCL 20 mmol/L　　　　SDS 10%　　　　胰RNA酶 20ug/ml　　　　（2） 蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。　　　　（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。　　　　（4）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）　　　　（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。　　　　三、操作步骤　　　　1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（12.5px3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。　　　　2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）　　　　3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。　　　　4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。　　　　5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。　　　　6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。　　　　7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。　　　　8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。　　　　9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。　　　　10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。　　　　四、常见问题　　　　1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。　　　　2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。　　　　3. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。　　　　4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。　　　　5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。　　　　6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。

　　菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的形状，防止变异。不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。　　　　短期：斜面保藏　　　　斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作简单，使用方便，但需定期接种。因此工作量较大，而且传代次数多易发生变异，因此，仅适用于短期经常使用的菌种。　　　　1. 配制培养基，营养成分浓度稍低为宜，特别是糖类尽可能降低，产酸菌种，则应添加少量碳酸钙；　　　　2. 斜面装液量，斜面以倾斜后不超过试管长度 1/2 为宜；　　　　3. 斜面培养，温度较最适稍低，时间较最适略长；　　　　4. 生长完成后，密封置于 2~8℃的冰箱中保藏。每传代一次，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存 1~3 个月，酵母菌 2 个月，细菌1个月。　　　　活化使用：　　　　将斜面从冰箱中取出，细菌挑取菌落增菌，或霉菌切块传代培养，培养好即可使用。　　　　长期：冷冻保藏　　　　冷冻保藏是目前使用较为广泛的长期保藏法之一，适用于所各类微生物，较之于斜面保藏，减少了工作量，延长了保藏时间。　　　　1. 准备斜面或平板新鲜培养物一个，10%的无菌甘油溶液；　　　　2. 用甘油溶液将菌体或孢子洗脱下来，形成菌悬液；　　　　3. 菌悬液分装，冻存管装液 1mL/支，后置于程序降温盒；　　　　4. 将程序降温盒置于-80℃冰箱冻存；　　　　5. 可保藏 1-2 年。　　　　活化使用：　　　　1. 将冻存菌株置于冻存盒中取出，准备水浴溶解，切勿常温融化；　　　　2. 将菌株迅速置于水浴速溶，细菌 40℃，真菌 30℃，约 2min 全部溶解后接种到适宜培养基；　　　　3. 采用适宜条件培养完成即可。

　　生化试剂常见问题的解决办法　　　　1 .样品信息　　　　样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定成果发生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测形式，并在成果核算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。　　　　2 .试剂空白　　　　试剂空白吸光度是反映试剂质量的目标。每种试剂都有必定的空白吸光度规模，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；有些试剂久置后变浑浊。这些状况均可使空白吸光度升高。往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，将就过试剂空白核对的“关”，其成果为如下状况：　　　　①线性规模变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量缺乏；试剂成份稳定性较差。　　　　② 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定成果有严峻系统误差。原因：试剂底物浓度缺乏。　　　　③低值偏高 现象：试剂空白的改变曲线（吸光度VS时刻）显着动摇。原因：试剂自身不稳定，自行分解；东西酶纯度不够，杂酶含量超限，导致干扰效果。　　　　3 .测定规模　　　　每种待测物都有一个可测定的浓度或活性规模，样品成果若超越此规模，分析仪将显示成果超越规模的提示。表明试剂现已变质，应更换合格试剂。　　　　4 .底物耗尽　　　　使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性十分高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超越某一吸光度改变规模，监测期的吸光度将偏离线性，使测定成果不可靠。　　　　5 .酶的预活化　　　　测定血清中的某些酶，如CK，离体（采血）后很简单失活。只有通过适当的还原效果才能重新激活。在AST，ALT采用IFCC推荐办法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的成果要高些。　　　　6 .校准与成果溯源性　　　　酶的校对：要满足在同一办法学、同一测定条件、与理论核算的FACTOR值差异不大，没有发现有显着影响因素，方可进行校对。

紫外可见分光光度计是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光吸收作用，对物质进行定性分析，定量分析及结构分析，所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。按照所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。特点1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快；2 灵敏度高；3 选择性好；4 精密度和准确度较高；5 用途广泛。组成结构1 光源（1）光源：提供符合要求的入射光。（2）要求：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱， 具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。2 单色器（1）单色器：将光源发射的复合光分解成连续光谱并可从中选出任一波长单色光的光学系统。（2）单色器主要由狭缝、色散元件和透镜系统组成。Ø色散元件是棱镜和反射光栅的组合。Ø狭缝和透镜系统控制光的方向。（3）棱镜单色器Ø利用不同波长的光在棱镜内折射率不同将复合光色散为单色光。（4）光栅单色器Ø一系列等宽、等距离的平行狭缝Ø以光的衍射现象和干涉现象为基础（平面反射光栅和平面凹面光栅）3 吸收池（1）吸收池：又叫比色皿，用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件。（2）主要有石英吸收池和玻璃吸收池两种。（3）在紫外区须采用石英吸收池，可见区一般用吸收玻璃池。（4）主要规格0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm。注意事项：手执两侧的毛面，盛放液体高度四分之三。4 检测器（1）检测器：利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号。（2）常用的检测器有光电池、光电管及光电倍增管。5 信号显示系统（1）以检流计或微安表指示仪表。（2）数字显示和自动记录型装置。操作步骤（1）打开电源开关。（2）检验吸收池的成套性（具体过程在后面内容中操作）。（3）选择工作波长（按设定键，以及增加、减小按钮，进行设定）。 （4）选择测量方式（按方式键选择透射比模式与吸光度模式）。（5）润洗比色皿，依次装入参比溶液和测量溶液。 （6）参比溶液于光路中，透射比模式下同时调0和100%。（7）在吸光度模式下，测定测量溶液的吸光度。

化学试剂在贮存过程中是否会发生变质，取决于内外两个方面的因素，内因是试剂本身化学结构所决定的理化性质；外因则是试剂所处的环境条件。要做到合理保管，一要了解试剂结构与性质间关系，二要创造适应试剂贮存的外部环境。1、化学试剂变质的原因环境主要是指贮存的温度、光照和介质。介质一般是指空气和混有的杂质。贮存室里除空气中含有的氧、二氧化碳和水蒸气以外，还往往含有存放的各种挥发性试剂扩散到空气中的蒸气，常见的有氯化氢、硝酸、硫化氢、二氧化硫、溴、碘、乙烯、甲醛等蒸气；另外还有飘混在空气中的尘埃，其中有无机物也有有机物及各种微生物。化学试剂在一定的温度、光照、介质条件下会逐渐变化以致变质，该过程有物理变化，亦有化学变化。前者使化学试剂产生损耗，后者则能使试剂完全变质失效。引发和促使化学试剂发生变化的原因，大致可归纳如下。a. 挥发挥发是挥发性试剂造成试剂损耗、浓度改变、规格下降的最常见的原因。挥发性试剂的一般特点是：分子量较小、沸点较低。常见的无机试剂有：浓盐酸、浓硝酸、发烟硫酸等，有机试剂则有碳原子数较少的液态物质，如：甲醇、乙醇、石油醚、汽油等。b. 升华具有升华性质的一类试剂一般是升华热较少的分子晶体。实验室里一般有室温下升华的试剂(如碘萘等)和受热条件下升华的试剂(如硫与氯化汞)两种。这类试剂的升华主要造成损耗和污染空气。c. 潮解和稀释能发生潮解的化学试剂为数不多，它们大部分是易溶性化合物，一般阴离子半径远小于阳离子半径，也有阴阳离子半径相近而阳离子所带电荷较多。此类试剂吸收水分在表面形成饱和溶液后，若产生的水蒸气气压小于空气中的水蒸气分压，潮解将继续进行，直至全部形成溶液。如：氢氧化钠、碱石灰等，有机物中易潮的有醋酸钠、醋酸铵等。稀释是指试剂溶液吸收空气中的水分导致浓度下降变稀的现象。发生原因与潮解一样，是外界水蒸气分压大于试剂的水蒸气分压所致。易发生稀释现象的常见试剂有浓硫酸、正磷酸、乙二醇等。d.风化风化的原因和潮解相反，是结晶水合物的水蒸气分压高于空气中水蒸气分压的缘故。空气越干燥，风化速度越快。实验室中常见的易风化剂 有：Na2CO3•10H2O、Na2SO4•7H2O、CuSO4•5H2O、MgSO4•7H2O、ZnSO4•7H2O等。发生风化虽未波及试剂的化学性质，但使试剂外观改变，质量减少。e. 浓缩和析晶浓缩和析晶产生的原因是在环境干燥的条件下，试剂溶液的水蒸气压高于外界空气中水蒸气压，造成溶液水分的蒸发而浓缩、析晶，各种固体溶质的试剂一般均有此类现象，特别是一些浓度较大的溶液，浓缩和析晶虽对瓶中试剂性质影响不大，但也会改变其浓度、规格和外观。对某些溶点较低的有机物，在外界温度下降较大的情况下，也会发生析晶现象，比较明显的例子是冰醋酸。f. 水解容易水解的盐类试剂大都具有共价键，凡是强酸和弱碱和弱酸和弱碱所生成的盐，遇水都会发生不同程度的水解。实验室中一些金属元素的卤化物很容易水解，如：TiCl4、AlCl3、FeCl3、SnCl2, 等，它们是带电荷高、半径小的阳离子化合物或是非惰气型的阳离子化合物。此类试剂可因易吸水水解而变质，易水解的有机物是含有酰基的化合物，如：酯、酰卤等物质。g. 分解分解反应也是引发和促进试剂损耗和变质的原因。试剂的分解速度通常和环境温度密切相关。温度高分解速度加快，通常易分解的二元化合物其化学键键能较低。键能越低，越易分解，例如：碘化合物就比溴化物更易分解。有的分解反应还和试剂的含水量有关，如：硫酸氢铵，含水量越大，温度越高分解速度也越快。而含氧酸盐，如：硝酸盐、高锰酸盐则要在受热时才发生分解。h. 氧化和还原通常易被氧化的是标准电极电位低，具有还原性的试剂，它的名称中常常带有“低”或“亚”字。还有部分活泼金属和非金属单质，过氧化物及某些有机试剂，常见的有硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、亚硫酸、无水亚硫酸钠、钠、钾、钙、锌粉、还原铁粉、乙醛等。还原性越强的试剂越易因氧化而变质。使其氧化的原因是空气中的氧和具有氧化性的杂质所为。标准电极电位较高的试剂，在以固态形式存在时，通常在空气中比较稳定，如：高锰酸钾、重铬酸钾等。但以溶液存在时就易和空气中的一些还原性杂质，如H2S，SO2等作用而变质，如：KMnO4，Na2S2SO4，K3Fe(CN)6等溶液。i. 非氧化——还原反应有些试剂的变质并非一定要引起元素价态的变化，即发生非氧化——还原反应也能使其失效。实验室中最常见的实例，如：生石灰因吸收水分变成熟石灰，进一步吸收二氧化碳而失效；氢氧化钠和氢氧化钾固体也因吸收二氧化碳而带有杂质，若长期暴露在空气中则完全转化成碳酸盐；此外氧化镁、氧化钡、氢氧化钡也应防止它们和空气中二氧化碳反应。J. 聚合和缩合分子结构中含有不饱和双键或叁键的有机物质容易发生聚合，如：甲醛溶液常会聚合生成白色的三聚甲醛，氰化钾试剂也易聚合。有电荷高、半径小的中心离子形成的含氧酸盐溶液则能因缩合而析出多酸盐沉淀，如：钼酸铵溶液 能缩合析出四钼酸铵沉淀，三聚甲醛经加热处理 尚可重新释放出甲醛气体，但有些试剂，一旦发生聚合或缩合反应，往往是不可逆的，从而造成变质失效。k. 光化学反应光作为一种能量也能使某些试剂反应而变质。光能引发分解反应导致银盐分解就是实例。光也能引发氧化反应，如：苯甲醛在光照下，易被空气氧化成苯甲酸，苯胺则能从无色变成棕色。此外，碘化汞、邻苯三酚、氯仿，硫酸汞、亚铁氰化钾等也易发生光化学反应。l. 霉变所谓霉变则指在化学试剂中霉菌滋生繁殖的现象。在空气中尘埃里含有无数菌类微生物，在一定温度条件下就能繁衍。实验室中的碳水化合物，酯类、蛋白质类试剂，含有氮、硫、磷的有机试剂正是菌类繁衍的良好营养物质和温床。上述试剂只要密闭不严与空气有所接触皆可发生霉变。化学试剂因上述原因发生各种变化，通常借助颜色、形态、气味、数量增减均可察觉，而有的变化则需用实验方法方可判别，如：无水酒精是否已含有水分，只能用专门的试剂标准和检验方法加以测定才能确定。因此，科学贮存各类试剂乃是一种用心细致的工作，其中大有学问和文章可作。2、如何预防、缓解化学试剂变质？为了保证化学教学、科研和化工生产的正常开展，降低试剂损耗，缓解试剂的变质，通常可采取以下方法与措施：a. 密封密封适用于易挥发、升华、潮解、稀释、风化、水解和氧化还原、霉变的所有化学试剂对于极易 分解产生气体的试剂，一般不完全密封，要适当留有余地，否则可能使容器破裂。除了一般密封外，可再加蜡封，或用自制硝罗酊封口，如：三氯化铝、五氧化二磷等。b.隔离能和空气、水作用的试剂，如：很活泼的金属和非金属应隔离存放在对试剂相对而言稳定的液体或惰气之中，钾、钠、钙浸没在机油中，黄磷则浸没在水中贮放。这种隔离方法也称液封法，前者叫油封，后者叫水封。水封存也可使某些容易挥发的试剂减少损耗。如：在装有液态溴、二硫化碳的试剂中加一薄层水，就能大大减少挥发损失和空气污染。实验室中无机、有机试剂种类繁多，性质各异，应注意合理分类存放。有机物、无机物分开，普通药品和危险的分开，氧化剂和易燃物、还原剂分解、易挥发性酸和碱分开。做到这几个分开，一可避免药品间的不良影响，二则即使有意外事故发生，也能免除药品的相互作用，而产生更大的隐患。c. 避光通常采用遮光性能较好的深棕色试剂瓶。将试剂放在暗处或遮光的专用试剂柜中。也可用照相纸的黑色厚纸包裹试剂瓶，如：浓硝酸、碘化钾、碘化钠、氯化汞的贮存就是如此d. 低温普通挥发性试剂常放置在阴冷处，如：浓硝酸、浓盐酸、氨水等。某些特殊的生化试剂则要贮放在水箱或冰箱之中，如：酶试剂等e. 通风尽管装化学试剂的容器一般都处于密封状态，但也难免有跑、冒、漏、泄发生，在夏季高温天气，更易形成爆炸性混合气体，因此，贮藏室必须通风良好，应安装专用排风扇，并经常开启，使空气流通。f. 适时这是根据某些试剂的特性，特别是一些极易变质失效的试剂应采取适当措施，应做到适时配制、适时使用和及时处理。如：极易氧化的氢硫酸溶液、氯水、溴水、碘水最好适时制备及时使用；做银镜反应的 !"硝酸银溶液、氨水、乙醛溶液配好后，应及时使用才不致影响效果；硫酸亚铁溶液配好后应加些还原铁粉才能使其不被氧化；淀粉、蔗糖、蛋白质的溶液在使用后应及时清洗试剂瓶，以防霉变。上述诸种试剂在配制时除应注意适时外，配制数量也应根据需要而定，以免过剩造成浪费。

　　一、自行配制的标准溶液必须具备的基本要求　　　　1.应采用具有高纯度的溶质或基准物质(如金属、金属氧化物或金属化合物;酸、碱、金属有机化合物、适宜的盐类、有机溶剂等)。　　　　2.为确保配制标准溶液的可靠性、准确性,实验室的设备、环境设施均应满足其要求,(应有监测、控制和记录环境条件。特别对灰尘、电磁干扰、放射、温度、湿度、供电等)。　　　　3.具有符合称量要求器具、应有正确称量的电子分析天平,并通过周期性的检定,有质检部门检定的证书。　　　　4.要有配制标准溶液的纯度高的溶剂(采用双重蒸馏去离子水、高纯浓度的酸、碱或有机溶液)。　　　　5.配制所用的器皿用具,必须根据所测项目要求,分类对器皿进行洁净的处理,且符合特定洁净的要求,保证所配的标准溶液无污染,对检测不产生不良影响。　　　　6.应采用洁净的优质硬玻璃容量瓶作最终体积的容器。　　　　7.根据所配标准溶液对盛放容器的要求,必须选用适当质料的洁净器皿存放标准溶液,并按规定要求(如避光、通风、阴凉、冷藏等条件)放置配制好的标准溶液。　　　　8.必须作好配制标准溶液的原始记录的登记,标准溶液标签填写完整(如标准溶液名称、浓度mg/ml或mol/ml,配制人,配制日期、有效期等),并将标签贴在试剂瓶上。　　　　二、金属标准溶液的配制和标定　　　　1.水溶性金属标准溶液的配制　　　　直接用经酸清洗或打光的高纯金属丝、棒、片,或高纯金属氧化物,或优级纯的(光谱级、基准纯度的)金属盐类,溶解于高纯度的酸中,加双重蒸馏去离子水配制成酸性水溶金属标准溶液。　　　　2.非水金属标准溶液　　　　将高纯或优级纯以上的金属有机化合物溶解于合适的高纯有机溶液中;(以C或C脂肪族酯或酮、C烷烃为佳)配制成非水金属标准溶液,或将金属离子转变为可萃络合物,用合适的高纯有机溶液萃取,有机相中的金属离子的含量通过它在测定水相中的含量,间接地加以标定。　　　　3.标准贮备液　　　　配制成的标准溶液,贮备液浓度一般为1.00mg/1.0mL,或100μg/1.0mL,含酸量为10%。如,用高压聚乙烯瓶盛装并且密封好,常温下可保证2周,4℃冰箱中冷藏4周,其含量可保持基本不变。　　　　4.标准工作液用贮备液　　　　稀释成工作液溶液的酸度为5%,选用适合存放溶液的酸度为5%的硬质玻璃瓶,常温下可保存2～3个月其含量不变。　　　　5.标准工作液稀释成使用工作液　　　　溶液的酸度为1%酸度时,玻璃瓶装1周内不变;溶液的酸度为0.2%酸度,用玻璃瓶装的只能当天配当天使用,如用高压聚乙烯瓶盛装可保存1周,用四氟乙烯瓶装则保存的时间可为2个月左右。　　　　6.酸化的金属标准液　　　　金属标准溶液用盐酸酸化至pH=2.0时,用聚乙烯容器瓶盛装,可保证金属元素不受损失其结果令人满意;贮备液浓度应于1.0mg/ml以上;硬质玻璃瓶和塑料瓶中元素的数值,其未经盐酸酸化的比经过盐酸酸化的损失要少;浓度　　　　三、常用标准溶液(水溶液)的配制和标定　　　　　1.标准溶液的标定　　　　用优级纯以上的酸、碱或强溶解性的相应盐类等基准物质,用双重蒸馏去离子水溶解于容量瓶中,并定容至所需的贮备溶液,浓度为(mol/L),并按要求选取洁净容器盛装,贴好标签,按规范要求贮存。　　　　标定物质　　　　2.应选用基准物质的纯试剂作为标定物质,标定前应干燥至恒重,并准确称取。　　　　　3.标定过程　　　　标准溶液在标定过程中,严格执行2人双平行标定,用精确的标定物,对标准溶液进行标定、计算,在误差很小,数据又相当接近的情况下,则取平均值为该标准溶液的浓度。　　　　　　4.标定时间　　　　常温下1.000mol/L及以上浓度贮备液,应每2a标定1次;0.5000mol/L浓度贮备液,应每1a标定1次;0.1000mol/L浓度贮备液,应每6个月标定1次;低于0.1000mol/L浓度的应用液,应每3个月标定1次。　　　　注意事项：　　　　自配制的标准溶液作为工作标准溶液的,一般用于日常检验分析,不用于其他具有法律效应的检测结果。除非能够证明其作为测量参考标准的性质不会失效。有机溶液的标准物质在贮存过程中,应避免标准溶液与塑料胶木瓶盖直接接触。对使用量较大的自配的标准贮备原液,必要时与有证的、并在有效期内的标准物质进行比对,避免发生化学变化,以确保自配标准溶液量值的准确性。

　　原理　　　　由于 浓盐酸容易挥发，不能用它们来直接配制具有准确浓度的 标准溶液，因此，配制HCl标准溶液时，只能先配制成近似浓度的溶液，然后用基准物质标定它们的准确浓度，或者用另一已知准确浓度的标准溶液滴定该溶液，再根据它们的体积比计算该溶液的准确浓度。　　　　标定HCl溶液的基准物质常用的是无水Na CO ，其反应式如下：　　　　Na CO +2HCl→2NaCl+CO +H O　　　　滴定至反应完全时，溶液pH为3.89，通常选用 溴甲/酚绿—甲基红混合液作 指示剂。　　　　试剂　　　　1.浓盐酸（密度1.19）　　　　2.溴甲/酚绿-甲基红混合液指示剂：量取30mL溴甲/酚绿乙醇溶液（2g/L），加入20mL甲基红乙醇溶液（1g/L），混匀。　　　　步骤　　　　1．0.1mol·L 1HCl溶液的配制　　　　用量筒量取浓盐酸9mL，倒入预先盛有适量水的试剂瓶中，加水稀释至1000mL，摇匀，贴上标签。　　　　2．盐酸溶液浓度的标定　　　　用减量法准确称取约0.15g在270~300℃干燥至恒量的基准 无水碳酸钠，置于250mL锥形瓶，加50mL水使之溶解，再加10滴溴甲/酚绿-甲基红混合液指示剂，用配制好的HCl溶液滴定至溶液由绿色转变为紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。由Na2CO3的重量及实际消耗的HCl溶液的体积，计算HCl溶液的准确浓度。

　　琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。　　　　琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA－－片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA－－片段。　　　　操作流程　　　　准备干净的配胶板和电泳槽　　　　注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。　　　　选择电泳方法　　　　一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。　　　　正确选择凝胶浓度　　　　对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。　　　　适合的电泳缓冲液　　　　常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。　　　　电泳的合适电压和温度　　　　电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象　　　　DNA样品的纯度和状态　　　　是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。　　　　DNA的上样　　　　正确的DNA上样量是条带清晰的保/证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚**缺失。Yuanmu生物DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。　　　　Marker的选择　　　　DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA－－片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。Yuanmu公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。　　　　凝胶的染色和观察　　　　实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。Yuanmu的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。　　　　步骤如下：　　　　1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml): 称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次**琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.　　　　2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直**凝胶完/全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液**没过胶板1-2㎜为止.　　　　3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的**终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样要先记下加样的顺序).　　　　4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负(黑色)向正(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.　　　　(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.　　　　(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.

　　研究实验中，我们常常用到一个高大上的仪器――流式细胞仪，而与之相对应的就是流式细胞术，可是大家对它们都了解多少呢？今天远慕就带着大家好好地认识一下。　　　　流式细胞术　　　　流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。其特点是:第一，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞。第三，同时测量每个细胞的多参数特征。第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些实验，这就是分选技术。　　　　那么，具体是如何通过FCM实现分选的呢？　　　　1、首先，制备单细胞悬液　　　　将待测细胞或微粒制成单细胞悬液，经特异性荧光染料标记抗体进行染色，在恒定气体的压力下进入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度，鞘液包绕着样品高速流动，组成一个圆柱形的液流束，待测细胞或微粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。　　　　2、其次，收集单细胞上的荧光信号　　　　流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，细胞或微粒上的荧光染料被激发，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。　　　　3、再次，统计结果　　　　荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度，经光电转换变为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机上。　　　　4、最后，做细胞分选　　　　细胞的分选是指根据所测定的各个参数将指定的细胞从细胞群体中分离出来的一种方式，通过分离含有单细胞的液滴实现。在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。　　　　流式细胞术动用了现代多科高技术，能够同时定量检测检测单个细胞的多项指示，显示出无比优越性，已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、临床医学、基础科学研究、海洋生物以及分选应用等研究领域。　　　　这么高级的单细胞统计仪器，到底能做哪些实验呢？　　　　比如，细胞计数标记可以帮助分析细胞，我们以此为例说明流式细胞仪的应用。　　　　如图，一个点表示一个细胞，纵坐标表示荧光散射，将细胞分散开；横坐标表示荧光强度，荧光强度越强，结合的抗体越多，表达的NKp46越多，说明该表达Nkp46的细胞群为NK细胞。结果显示： 在C57BL/6小鼠的脾脏和血液中均可检测到NKp46的表达；在B-NDG小鼠中未检测到NKp46的表达，表明B-NDG小鼠中没有NK细胞。　　　　T细胞、B细胞和NK细胞的检测　　　　取BALB/c、NOD-scid和B-NDG小鼠的外周血细胞，并通过流式对比其中T 、B和NK细胞的组成（A）并进行统计对比（B）。图3A横坐标/纵坐标都表示荧光强度，荧光强度越强，抗体表达量越多，则表达这些marker的相应细胞存在。B-NDG小鼠CD3、CD19和NKp46的相对应区域没有荧光，说明B-NDG小鼠中表达CD3、CD19和NKp46的成熟T,B和NK细胞不存在。结果：B-NDG®小鼠外周血中缺乏成熟的T细胞、B细胞和NK细胞。

　　单克隆抗体的优点与局限性：单克隆抗体和多克隆抗体各有其优点和局限性，只有对它们有全面的了解，才能根据不同应用领域的要求，正确的选择和应用。　　　　一、单克隆抗体　　　　单克隆抗体的定义:　　　　单克隆抗体是仅与目标蛋白某一特定表位结合的单一抗体。　　　　单克隆抗体的制备：　　　　简单来说就是将免疫原注射到宿主动物体内产生免疫反应，之后把 B 细胞从脾脏中移出，单种 B 细胞与骨髓瘤细胞融合为 B 细胞杂交瘤，成为一个永生化胞株。这样一来，杂交瘤的 B 细胞就会一直产出只识别单一表位的单克隆抗体，通常这个胞株会有一个特定的克隆号（clone number），用来与其他胞株区分。杂交瘤接下来可以被注射到小鼠的腹腔中大量生产，杂交瘤分泌富含抗体的一种液体，被称作腹水，用注射器抽取纯化，就可获得大量的单克隆抗体。　　　　单克隆抗体更适用于:　　　　1、检测单一抗原　　　　2、检测蛋白质家族的单一成员　　　　3、不同实验/批次的抗体检测结果稳定一致　　　　4、细胞染色背景较低-很适用于 IHC、ICC、IF 等应用　　　　5、量化蛋白质表达 (例：流式或荧光细胞分选)　　　　6、探测分子结构变化　　　　7、探测磷酸化状态的变化　　　　8、为 X 射线晶体测试探测目标　　　　9、制作缺少特定细胞类型的动物模型　　　　10、免疫治疗　　　　单克隆抗体不建议用于:　　　　1、根据同源性检测不同物种的目标蛋白　　　　2、检测浓度较低的目标蛋白　　　　3、检测形态变化了的蛋白　　　　二、多克隆抗体　　　　多克隆抗体定义　　　　多克隆抗体是指与目标蛋白上多种不同表位结合的多种不同抗体.　　　　多克隆抗体制备　　　　多克隆抗体的第一步和单克隆抗体一样，都是将免疫原注射到宿主体内产生免疫反应，激活了多种B细胞。不同的是免疫过后，多克隆抗体就直接从免疫宿主的血清中分离出来，或接着进行纯化，没有与骨髓瘤细胞融合的过程。一旦宿主动物死亡，需要免疫新的动物，这时血清中的抗体就会有所不同。虽然多抗每批次有轻微差别，但是因为它识别的表位多，这个差别影响并不算太大，而单克隆抗体虽然价格偏高，可是特异性更强更稳定。可以说单抗和多抗是各有各的优点。　　　　多克隆抗体更适用于:　　　　1、检测有高同源性的抗原的已知或未知同种型　　　　2、检测浓度较低的抗原　　　　3、捕获尽可能多的抗原 (例如 IP 或 ChiP)　　　　4、检测变性的蛋白　　　　5、检测可能发生了糖基化或形态变化的目标蛋白　　　　6、用多种检测方法检测一种原蛋白时　　　　7、检测 pH 和盐度不同的溶液中的目标蛋白　　　　多克隆抗体不建议用于:　　　　1、量化检测，比如：流式。由于不同表位的结合导致信号被放大加强，可能会导致结果不准确　　　　2、当高同源性蛋白的交叉反应会引起问题时　　　　三、多克隆抗体和单克隆抗体的用途　　　　1、定义多克隆抗体和单克隆抗体有用性的两个关键特征涉及它们各自对抗原的特异性和灵敏度。　　　　2、抗体的特异性是由其结合域和目标抗原之间的相对亲和力决定的，而其他分子是存在的。对这种特异性的利用对免疫学研究人员和临床医生来说是至关重要的，因为许多应用都是利用多克隆和/或单克隆抗体来专门检测目标分子。结合抗原特异性，抗体的灵敏度是一个重要的参数，决定了它在实验室的实用性。　　　　3、高灵敏度的抗体非常适用于诊断应用，如免疫沉淀、West Blot 和酶联免疫吸附试验（ELISA），因为它们能够识别低水平的目标抗原。　　　　免疫沉淀是一种分析技术，通过使用特异性结合抗原的抗体将抗原从混合物中分离出来。然后用固定化抗体或磁珠对产生的抗原-抗体复合物进行进一步处理，从而使抗原-抗体复合物在分析前从混合物中分离出来。　　　　4、与免疫沉淀法一样，ELISA 可以使用多克隆或单克隆抗体来检测溶液中的目标抗原。　　　　5、间接和夹心 ELISA 是两种免疫测定形式，在整个过程中使用两种类型的抗体：单克隆抗体由于对目标抗原的高特异性，通常首先应用（一级）；多克隆抗体由于能够以高灵敏度放大低信号，因此作为二级试剂更有用。　　　　6、除了 ELISA，抗体对于免疫组化和流式细胞仪等检测技术也很有用，因为它们可以以高分辨率检测复杂组织或细胞内的抗体-抗原构建。　　　　生产企业对抗体特异性和灵敏度的确认使得像 ELISAs 这样的免疫测定可以根据抗原和抗体的使用方式而采取不同的形式，这使得这些测试具有高度的通用性。例如，一种免疫测定需要高度敏感的测试来检测一种未知的病原体，由于多克隆抗体能够识别一种抗原上的多个表位，因此会从多克隆抗体中获益。如果一个病原体或抗原先前已经被定性，那么在下游应用中使用单克隆抗体来进一步定性可能更合适。　　　　7、在实验室外，抗体可以被用来增强、模仿或恢复免疫系统攻击疾病目标的能力。除了一些例外，单克隆抗体比多克隆抗体更适合于治疗目的，因为它们具有同质性，对单一表位的高特异性和低程度的交叉反应。　　　　8、这些特性对于有效的癌症治疗特别重要，因为肿瘤细胞能够逃避或阻断免疫系统。单克隆抗体疗法对癌细胞发挥作用的一些方式包括涉及直接结合以诱导细胞死亡的机制和阻断肿瘤生长因子和血液供应的间接机制。

　　标准溶液是化学实验室用于分析工作的标准试剂的总称，标准滴定溶液是确定了准确浓度用于滴定分析的一种溶液。如何制备标准滴定溶液并保证其浓度的准确性是保证试样分析结果准确性的基础。　　　　标准溶液如何配置？制备标准溶液过程中需注重哪些问题？标准滴定溶液制备误差是什么？如何消除误差？远慕为你一一解读！　　　　对试剂和水的要求　　　　(1)试剂的纯度应在分析纯以上，且性质稳定，配成的溶液不易挥发和起其他变化。标定标准溶液必须用基准试剂。　　　　(2)配制标准溶液的实验用水应符合GB/T 6682中三级水的规格。　　　　标准溶液的配制与标定　　　　标准溶液在配制与标定过程中需注重的问题有哪些？　　　　（1）溶液配制中所用的水，在没有注明其它要求时，应符合GB/T 6682中三级水规格。　　　　（2）标定溶液和配制基准溶液所用试剂为容量分析基准试剂。配制一般溶液所用试剂纯度不低于分析纯。　　　　（3）溶液配制中使用的分析天平、滴定管、单标线容量瓶及单标线吸管等需按计量检定规程要求检定或校准。单标线容量瓶、单标线吸管应有容量校正因子。　　　　（4）称量工作基准试剂的质量小于或等于0.5g时，按精确至0.01mg称量；大于0.5g时，按精确至0.1mg称量。　　　　（5）标定标准滴定溶液浓度时，需两人进行实验，分别做四平行，每人四平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差0.15%，两人共八平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差0.18%。　　　　（6）在运算过程中保留5位有效数字，取两人八平行标定结果的平均值为标定结果，报出结果取四位有效数字。　　　　（7）制备标准滴定溶液的浓度应在规定浓度的±5%范围以内。　　　　举个例子：　　　　（一）氢氧化钠标准溶液的配制和标定　　　　一．目的要求　　　　1.掌握NaOH标准溶液的配制和标定。　　　　2.掌握碱式滴定管的使用，掌握酚酞指示剂的滴定终点的判断。　　　　二．方法原理　　　　NaOH有很强的吸水性和吸收空气中的CO2，因而，市售NaOH中常含有Na2CO3。　　　　反应方程式：2NaOH+CO2→Na2CO3+H2O　　　　由于碳酸钠的存在，对指示剂的使用影响较大，应设法除去。　　　　除去Na2CO3最通常的方法是将NaOH先配成饱和溶液（约52%，W/W），由于Na2CO3在饱和NaOH溶液中几乎不溶解，会慢慢沉淀出来，因此，可用饱和氢氧化钠溶液，配制不含Na2CO3的NaOH溶液。待Na2CO3沉淀后，可吸取一定量的上清液，稀释至所需浓度即可。此外，用来配制NaOH溶液的蒸馏水，也应加热煮沸放冷，除去其中的CO2。　　　　标定碱溶液的基准物质很多，常用的有草酸（H2C2O4•2H2O）、苯甲酸（C6H5COOH）和邻苯二甲酸氢钾（C6H4COOHCOOK）等。最常用的是邻苯二甲酸氢钾，滴定反应如下：　　　　C6H4COOHCOOK+NaOH→C6H4COONaCOOK+H2O　　　　计量点时由于弱酸盐的水解，溶液呈弱碱性，应采用酚酞作为指示剂。　　　　三．仪器和试剂　　　　仪器：碱式滴定管（50mL）、容量瓶、锥形瓶、分析天平、台秤。　　　　试剂：邻苯二甲酸氢钾（基准试剂）、氢氧化钠固体（A.R）、10g/L酚酞指示剂：1g酚酞溶于适量乙醇中，再稀释至100mL。　　　　四．操作步骤　　　　1.0.1mol/L NaOH标准溶液的配制　　　　用小烧杯在台秤上称取120g固体NaOH，加100mL水，振摇使之溶解成饱和溶液，冷却后注入聚乙烯塑料瓶中，密闭，放置数日，澄清后备用。　　　　准确吸取上述溶液的上层清液5.6mL到1000毫升无二氧化碳的蒸馏水中，摇匀，贴上标签。　　　　2.0.1mol/L NaOH标准溶液的标定　　　　将基准邻苯二甲酸氢钾加入干燥的称量瓶内，于105～110℃烘至恒重，用减量法准确称取邻苯二甲酸氢钾约0.6000克，置于250mL锥形瓶中，加50mL无CO2蒸馏水，温热使之溶解，冷却，加酚酞指示剂2～3滴，用欲标定的0.1mol/LNaOH溶液滴定，直到溶液呈粉红色，半分钟不褪色，同时做空白试验，要求做三个平行样品。　　　　五．结果结算　　　　NaOH标准溶液浓度计算公式：　　　　m CNaOH = （V1-V2）×0.2042　　　　式中：　　　　m---邻苯二甲酸氢钾的质量，g　　　　V1---氢氧化钠标准滴定溶液用量，mL　　　　V2---空白试验中氢氧化钠标准滴定溶液用量，mL　　　　0.2042---与1mmol氢氧化钠标准滴定溶液相当的基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g　　　　（二）盐酸标准溶液的配制和标定　　　　一．目的要求　　　　1.掌握减量法准确称取基准物的方法。　　　　2.掌握滴定操作并学会正确判断滴定终点的方法。　　　　3.学会配制和标定盐酸标准溶液的方法。　　　　二．原理　　　　由于浓盐酸容易挥发，不能用它们来直接配制具有准确浓度的标准溶液，因此，配制HCl标准溶液时，只能先配制成近似浓度的溶液，然后用基准物质标定它们的准确浓度，或者用另一已知准确浓度的标准溶液滴定该溶液，再根据它们的体积比计算该溶液的准确浓度。　　　　标定HCl溶液的基准物质常用的是无水Na2CO3，其反应式如下：　　　　Na2CO3＋2HCl →2NaCl＋CO2＋H2O滴定至反应完全时，溶液pH为3.89，通常选用溴甲酚绿—甲基红混合液作指示剂。　　　　三．试剂　　　　1.浓盐酸（密度1.19）　　　　2.溴甲酚绿-甲基红混合液指示剂：量取30mL溴甲酚绿乙醇溶液（2g/L），加入20mL甲基红乙醇溶液（1g/L），混匀。　　　　四．步骤　　　　1．0.1mol·L 1HCl溶液的配制　　　　用量筒量取浓盐酸9mL，倒入预先盛有适量水的试剂瓶中，加水稀释至1000mL，摇匀，贴上标签。　　　　2．盐酸溶液浓度的标定　　　　用减量法准确称取约0.15g在270~300℃干燥至恒量的基准无水碳酸钠，置于250mL锥形瓶，加50mL水使之溶解，再加10滴溴甲酚绿-甲基红混合液指示剂，用配制好的HCl溶液滴定至溶液由绿色转变为紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。由Na2CO3的重量及实际消耗的HCl溶液的体积，计算HCl溶液的准确浓度。　　　　五．注意事项　　　　干燥至恒重的无水碳酸钠有吸湿性，因此在标定中精密称取基准无水碳酸钠时，宜采用“减量法”称取，并应迅速将称量瓶加盖密闭。　　　　在滴定过程中产生的二氧化碳，使终点变色不够敏锐。因此，在溶液滴定进行至临近终点时，应将溶液加热煮沸，以除去二氧化碳，待冷至室温后，再继续滴定。　　　　还有氧化还原标准溶液的配制和标定呢！　　　　氧化还原滴定法是以氧化还原反应为基础的容量分析方法。由于氧化还原反应类型不同，所以标准溶液比较多。高锰酸钾法以KMnO4为标准溶液；重铬酸钾法以K2Cr2O7为标准溶液等。下面着重讲一下高锰酸钾标准深溶液的配制和标定。　　　　①高锰酸钾是一个强氧化剂，易受还原性杂质和有机杂质影响，所以KMnO4浓溶液配制后应加热煮沸，使各种还原物质完全氧化，再滤去杂质，静置15天，存放于棕色瓶中。　　　　②高锰酸钾标准溶液的酸度要适当。酸度应保持在1mol/L左右，酸度过低，则MnO-4部分还原为MnO2，析出棕色沉淀，过高使基准Na2C2O4分解。　　　　③温度要适当。将溶液温度加热到65℃左右可加速反应。当温度超过90℃时，在酸性溶液中会造成KMnO4、C2O42-分解;温度低于60℃时反应速度太慢。　　　　④滴定速度要适当掌握。滴定开始时KMnO4反应很慢，应等第一滴红色消失后再加第二滴。溶液中产生了Mn2+后，由于Mn2+的自催化作用,滴定速度可加快，但不能成线，以防止MnO-4分解。滴定到红色在30秒内不消失为止，作为终点。　　　　标准溶液保存　　　　(1)标准溶液应在室温20±5℃下存放，不要放在有加热设备的房间里。　　　　(2)标准溶液不应放在有酸碱和氧化还原性逸出气的环境中，应在瓶塞上加装过滤空气中杂质的保护管。酸标准溶液加酸石棉保护管以吸收碱性气体；碱标准溶液加碱石棉保护管，以吸收酸性气体。　　　　(3)易挥发，见光易分解的标准溶液应装在棕色瓶中，避光存放。　　　　(4)不能用吸液管直接从标准溶液中吸取标准液。　　　　(5)标准溶液在常温下保存不得超过两个月，氧化还原溶液一般一个月。　　　　总之，标准溶液在配制、标定、保存和使用过程中，要认真按规定进行各环节的工作，才能保证溶液浓度的准确性，以保证实验结果的真实、准确。　　　　小结：容量分析法中，以滴定分析用标准溶液对试样中欲测组分进行滴定，根据标准溶液的消耗量和浓度进行结果计算。因此标准溶液浓度的准确性对测试结果有直接的影响。所以在标准溶液的配制、标定和使用中要注意遵守注意事项哦！　　　　以上内容仅供参考，具体标准溶液配制及滴定方法请参考GB/T 601-2016 化学试剂标准滴定溶液的制备！

　　1、从物品、用品消毒灭菌着手　　　　细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作：75%的酒精搽拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒 30min，加入高压灭菌过的超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制300ml的饱和硫酸铜加3L灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。　　　　2、添加抗生素　　　　各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。　　　　3、从操作者做起　　　　（1）进无菌室前要彻底洗手，按规定穿隔离衣。开始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。　　　　（2）操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火；烧过的器械要冷却后才能使用；已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰是也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用。　　　　（3）操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。　　　　（4）使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。　　　　（5）操作完毕后应整理好工作台面，用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。　　　　（6） 吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。　　　　4、防止细胞交叉污染　　　　所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。　　　　5、无菌室的彻底消毒　　　　1） 新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室。使用前应稀释即配即用。新洁尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭500ml只需5元，而且可以稀释50倍用，而同样量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。　　　　2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。甲醛价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含37-40%的甲醛。　　　　其主要用法为：　　　　a）熏蒸消毒：每立方米空间甲醛用量为10~15毫升，熏蒸消毒时应密闭门窗封闭至少4h以上。高锰酸钾加40%甲醛（1:1）混合后放入一开发容器中，立即可见白色甲醛烟雾。消毒后可放入25%氨水蒸发中和刺激气味。氨水用量为所用甲醛水溶液的一半，时间为30分钟。甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定需带上防毒面具。　　　　b）自然挥发： 将较大量的甲醛水溶液放入一敞开容器中，室内温度保持在18摄氏度以上，同时室内喷水以保持相对湿度在70%以上，经16小时可达到室内消毒的目的

　　实验方法原理：本染色法是最基本的染色法，可使用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。　　　　实验步骤    　　　　一、实验试剂：　　　　1. 结晶紫溶液：　　　　A液：结晶紫：2g，95%乙醇：20ml。　　　　B液：草酸铵：0.8g，蒸馏水：80ml。　　　　需在用前24小时将A液. B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。　　　　2. 碘液：　　　　碘：1g，碘化钾：2g蒸馏水：300ml。　　　　出碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继  续加入少量蒸馏水至完全溶解，最后补足水量。　　　　也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。　　　　3. 脱色液：95%乙醇。　　　　4. 复染液：　　　　A.贮存液：沙黄：2.5g，95％乙醇：100ml。　　　　B.应用被：A液：10ml，蒸馏水：90ml。　　　　菌片制备：染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环蘸取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布，菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑去菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不易过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。　　　　二、染色方法：　　　　l. 涂片经火焰固定，加结晶紫液染1min，清水冲去染液。　　　　2. 加碘液染1min，水洗。　　　　3. 加脱色液，不时摇动约30秒，至无紫色脱落为止，水洗。　　　　4. 加复杂液，染30秒，水洗。　　　　5. 干后镜检。

冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取在原理上并没有显著的区别，两者都可以采用类似的方法进行RNA的提取。以下是关于两者RNA提取的详细比较：一、操作步骤相似性1.细胞裂解：无论是冻存细胞还是新鲜细胞，都需要通过细胞裂解来释放细胞内的RNA。这通常使用裂解缓冲液来破坏细胞膜和细胞核，使RNA能够被释放出来。2.RNA的释放：在细胞裂解的过程中，RNA会被释放到裂解液中。为保持RNA的完整性，应避免使用酶来降解RNA，并控制温度和pH值。3.RNA的纯化：裂解后，需要对裂解液进行纯化，以去除其他杂质和污染物。常用的纯化方法包括酚/氯仿法或硅胶柱纯化法。4.RNA的保存：提取纯化后的RNA应尽快保存起来，以防止其降解。常见的保存方法是在-80的低温冰箱中冻存RNA或使用RNA保存液进行长期保存。二、注意事项1.细胞裂解缓冲液的选择：应根据细胞类型和实验要求来确定裂解缓冲液的选择。2.RNA的完整性保护：在细胞裂解和RNA释放的过程中，应尽量避免RNA的降解，如控制温度和pH值等。3.纯化过程中的污染控制：在纯化RNA的过程中，应注意避免污染和杂质的引入，采用无菌操作，避免外源性RNA的污染。三、冻存细胞与新鲜细胞RNA提取的细微差别虽然两者在操作步骤和注意事项上大体相同，但冻存细胞在提取RNA时可能会受到冻存过程的影响，如细胞破裂或核酸降解等。这可能导致在提取核酸时出现一定程度的损失，影响核酸的纯度和完整性。然而，这种影响通常可以通过优化实验条件来减少。综上所述，冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取在原理和方法上大体相同，但冻存细胞可能会受到冻存过程的影响。在实际操作中，应根据具体情况选择合适的实验条件和方法来确保RNA提取的质量和效率。

抗酸染色的基本原理：分枝杆菌的植物细胞内带有很多的脂类，包围着在肽聚糖的外边，因此分枝杆菌一般不容易上色，要历经加温和增加上色时间来促进其上色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染剂融合后，就难以被酸碱性脱色剂褪色，故称抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加温标准下使分枝菌酸与石炭酸复红坚固融合成一氧化氮合酶，用盐酸乙醇解决都不褪色。当再加偏碱美兰复染后，分枝杆菌依然为鲜红色，而别的病菌及情况中的物质为深蓝色。制片：（1）涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。 拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。染色：（1）初染：滴加石炭酸复红溶液2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热5分钟，待标本冷却后用水冲洗。（2）脱色：（3）复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察:1、油不要滴太多2、在调节焦距的时候要特别注意与载玻片之间的距离不要弄坏工具3、调节时应该从下往上调节4、在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。5、用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。6、油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。结果判定:1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野质量控制：每次用卡介苗做阳性对照大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照注意事项：1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥

　　多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆，产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。　　　　一、单多抗优缺点　　　　多克隆抗体优点　　　　1.多克隆抗体有助于放大低表达水平的靶蛋白信号；　　　　2.能识别多个表位；　　　　3.比单克隆抗体更能容许抗原中的微小变化；　　　　4.识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质，或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白；　　　　5.多克隆抗体通常是检测变性蛋白质的首选；　　　　6.多表位通常可提供更为有力的检测。　　　　多克隆抗体缺点　　　　1.易于产生批次间差异；　　　　2.产生大量非特异性抗体，有时可能在某些应用中产生背景信号；　　　　3.不适用于探测抗原的特定结构域，因为抗血清通常可识别多个结构域。　　　　单克隆抗体优点　　　　1.杂交瘤制得后，就成为了恒定的再生源，所有批次都将相同；　　　　2.切片和细胞染色造成的背景较低。　　　　3.具有特异性，适于分析测定中的一抗或检测组织中的抗原，并且通常所产生的背景染色显著低。　　　　4.同质性非常高；　　　　5.单克隆抗体的特异性能使其在混合物中和抗原高效地结合。　　　　单克隆抗体缺点　　　　1.可产生大量特异性抗体，但可能特异性过强；　　　　2.经过抗原的化学处理后比多克隆抗体更易于丢失表位。这可通过使用同一抗原的两个或多个单克隆抗体进行补偿。　　　　二、单抗和多抗的选择　　　　如果对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多（WB/IP/IF/ICC等)，可以选择制备单克隆抗体。　　　　多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫检测时，更容易造成背景，例如在WB 中有杂带，在IHC 中背景较深等等。虽然还存在着交叉反应的问题，但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。另外多抗需要免疫原的量大，如果免疫原制备困难，建议制备单抗。　　　　若对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA检测，可以选择制备多克隆抗体。　　　　多抗相比较单抗仍然有制备时间短、首次制备成本低的特点，在一些情况下也是一种选择。另外，在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。　　　　三、抗原的选择　　　　抗原的选择可以是天然蛋白、重组可溶蛋白、重组变性蛋白和多肽，抗原质量越高，最终制备高质量抗体的几率也会越大！ 目前抗体制备常采用重组蛋白或多肽作为抗原。　　　　常规情况下，重组蛋白作为抗原往往含有更多的抗原决定簇，既有空间表位，也会有线形序列表位，对于机体的免疫刺激也会相对充分一些，那么最终获取应用面较广的抗体几率也会大很多，尤其是目的蛋白已证明有修饰或者复杂结构的，一般都会优先选择重组蛋白。　　　　当然也有必须用多肽制备的，比如对同源家族某一个蛋白抗体的制备，同源性非常高的，需要找到特异性aa合成多肽，再或者一些修饰化抗体，需要在多肽合成阶段定点修饰某些AA来制备抗体。　　　　抗原多肽选择一般遵循如下基本原则　　　　1.尽可能是在蛋白表面；　　　　2.保证该段序列不形成α-helix；　　　　3.N，C端的肽段比中间的肽段更好；　　　　4.避免蛋白内部重复或接近重复段的序列；　　　　5.避免同源性太强的肽段；　　　　6.交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端；　　　　7.序列中不能有太多的Pro，但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。

融合剂细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%～50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。1．试剂与材料(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。(2)1640培养液100ml。(3)完全1640液100ml。(4)2.5%FCS－1640液50ml。(5)HAT培养液100ml。(6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。(8)40孔塑料培养盘。2．操作方法⑴准备好脾细胞。⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。⑷移去上清液。⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。⑻重复⑺一次。⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。⑽重复⑼一次。⑾加1640液15ml。⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。⒂轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。细胞融合关键1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。2．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个无毒无菌的操作环境。

　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：　　　　一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。　　　　二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。　　　　三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。　　　　四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　　　　根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。　　　　在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。　　　　在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。　　　　假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。　　　　双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。　　　　双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。　　　　反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

培养基与菌种分离培养基与菌种分离是从含有多种微生物的样品中获得纯种微生物的操作技术。菌种分离主要在培养皿上进行，常用的方法是稀释法和划线法。使用这两种方法的目的是是微生物的一个个体通过繁殖，在固体培养基上长出肉眼能见的群体，根据培养特征，用接种针调取所需菌种并在显微镜下检查，证明为单一形状的菌体。常用的培养基是选择培养基。如分离分解纤维素的微生物用的培养基是以纤维素为碳源的培养基，因为从这种培养基上长出来的只能是分解纤维素的微生物。细菌的纯种分离和接种技术中，需要注意的事项有：稀释度的问题纯种分离的时候，无非是把菌液稀释一定梯度后，涂布在诸如LB培养基上。如果没有稀释好，就会导致细菌长得太密，或者是细菌根本不长。最优的稀释梯度是最后在平板上的菌落数在30至300之间。此时，能清楚地看清菌落的形态，便于挑取单菌落。基本形态与大小有以下几种类型：①单球菌：单独存在，如尿素小球菌；②双球菌：如肺炎双球菌；③链球菌：如乳酸链球菌；④四联球菌：形成的4个细胞排列在一起，成田字，如四联球菌；⑤八叠球菌：如尿素生孢八叠球菌；⑥葡萄球菌：如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。长宽相差较大的棒杆状或长杆状菌，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、梭状杆菌（Bacterium fusiformis）；分枝状或叉状菌，如双歧杆菌属（Bifidobacterium）；竹节状（两端平截），如炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）等。

甘油菌种复苏保存涉及几个关键步骤，‌包括菌种的保存、‌复苏以及再次保存的过程。‌以下是详细的步骤和注意事项：‌菌种保存：‌将菌种接种于LB液体培养基，‌并在对数生长期时，‌当培养体系内浑浊可见时，‌进行保存。‌准备50%浓度的甘油溶液，‌可以通过等体积的蒸馏水和甘油混合得到。‌在无菌条件下，‌将菌液与50%浓度的甘油按1:1的比例混合，‌使甘油终浓度达到25%。‌将混合液转移至2ml离心管中，‌并在-20°C冰箱内保存。‌这种条件下，‌菌种的保存有效期为1年。‌若需长期保存，‌建议在-70°C或-80°C下冻存，‌保藏时间一般为2-4年左右12。‌菌种复苏：‌在使用前，‌将保存的菌种在30°C水浴中解冻。‌解冻后，‌将菌液接种到固体培养基上，‌并在适宜条件下培养24-48小时，‌以恢复菌种的活性。‌再次保存：‌复苏后的菌种可以在新的液体培养基中继续培养，‌并再次进行甘油保存。‌这一过程确保了菌种的长期保存和可用性。‌注意事项：‌确保所有使用的工具和容器都经过适当的灭菌处理，‌以避免污染。‌在操作过程中保持无菌条件，‌以防止外界微生物的污染。‌正确的保存和复苏方法对于保持菌种的活性和纯度至关重要。‌保存的温度对菌种的长期存活有很大影响，‌低温条件有利于延长保存时间。

（一）核糖核酸酶A核糖核酸酶A（RNase A）来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端，切割胞嘧啶或尿嘧啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是3’嘧啶核苷酸和末端带3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。无辅助因子及二价阳离子存在时，核糖核酸酶A的作用可以被胎盘RNA酶抑制剂（RNasin）或氧钒一核糖核苷复合物（vanadyl—ribonuclosidecomplex，VRC）所抑制。RNase A的反应条件极广，且极难失活。在低盐浓度（0～100 mmol/l NaCl）下，RNase A切割单链和双链RNA、DNA：RNA杂交体中的RNA；当NaCl浓度为300 mmol/l。或更高时，RNase A就特异性切割单链RNA。去除反应液中的RNase A，通常需要蛋白酶K处理、酚反复抽提和乙醇沉淀。在分子克隆中，核糖核酸酶A的主要用途为：①从DNA：RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。②确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置。在RNA：DNA或RNA：RNA杂交体中，若存在单碱基错配，可用RNAse A识别并切割。通过凝胶电泳分析切割产物的大小，即可确定错配的位嚣。③RNA检测。RNA酶保护分析法（RNase protection assay）是近年来发展起来的一种检测RNA的杂交技术。其基本原理是利用单链RNA探针，与待测的RNA样品进行杂交形成RNA：RNA双链分子，由于RNA酶可专一性地降解未杂交的单链RNA，而双链受到保护不被降解，经凝胶电泳可以确定目的RNA的长度。该方法灵敏度较Northern杂交法更高，并可进行较为准确的定量。选择适当的探针，还可进行基因转录起始位点分析及内含子（也称内元）剪切位点分析等研究。此法的灵敏度比核酸酶S1保护分析法高数倍。④降解DNA制备物中的RNA分子。须使用无DNAsd的RNase（DNase I free RNase），市售的一般RNase A常含有DNase，可在100 retool/I Tris—CI（pH 7．5）和15 mmol/l。NaCI溶液中100℃加热15 min，以去除之。（二）核糖核酸酶T1核糖核酸酶T1（RNase T1）来源于米曲霉（Aspergillus orjzae），它特异地作用于鸟嘌呤3’端磷酸，切割位点在鸟嘌呤的3’磷酸和相邻核苷酸的5‘羟基之问的磷酸二酯键，反应终产物为3’鸟苷酸和末端带3’鸟苷酸的寡核苷酸片段。RNaseTl的反应条件极广，且极难失活，其催化活性类似于RNase A。在RNA酶保护实验中，RNase T1与RNase A联合使用，对RNA进行定量和作图；还可用于去除DNA：RNA杂交体中未杂交的RNA区。（三）核糖核酸酶H核糖核酸酶H（RNase H）最早是从小牛胸腺组织中发现的，其编码基因已被克隆到大肠杆菌中。它能特异地降解DNA：RNA杂交双链中的RNA链，产生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和单核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA或RNA。在分子克隆中，核糖核酸酶H的主要用途是与大肠杆菌DNA聚合酶工和DNA连接酶一起参加cDNA克隆中第二条I）NA互补链的合成。当用逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链之后，用RNase H部分消化mRNA：DNA杂交分子中的RNA，产生的RNA片段就像冈崎片段一样，作为大肠杆菌DNA聚合酶T的引物，以cDNA第一链为模板合成DNA，直到把mRNA全部代替。然后在DNA连接酶的作用下，封闭缺口形成双链cDNA。

磁珠法核酸提取试剂盒原理是通过特殊条件快速裂解样本，并利用磁珠颗粒特异性吸附核酸，经过洗涤和洗脱，达到快速分离核酸的目的。试剂盒提取效率高，性能稳定，提取纯化的核酸可用于酶切、反录、PCR、 RI-PCR、 Southern blot等各种常见下游实验。磁珠法核酸提取试剂盒目前主要被用于多种类型的生物样本中病毒核酸的提取、富集、纯化步骤，其处理后的产物用于临床体外检测使用。磁珠法提取试剂常见成分SDS（十二烷基硫酸钠)——性质:1、阴离子表面活性剂：对人体微毒；2、优异的发泡剂：广泛用于洗衣粉、牙膏、洗发水、灭火器；3、易溶于热水：当水温高于8℃（≈）时，SDS的溶解度随水温升高而急剧升高。当水温升至70℃（≈），溶解度升高不明显。SDS（十二烷基硫酸钠)——作用:它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构，使蛋白质变性。在高温下可以破坏蛋白质与核酸的结合，促进核酸释放。乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40 ）：NP-40是一种很温和的非离子型去垢剂，1%浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱。弱阳离子螯合树脂（Chelex-100）：提取液里面bling，bling的小珠子是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。知识点：chelex-100在模板中残留过多会影响PCR扩增蛋白酶K（Protein K）：是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中 。聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100——曲拉通）：曲拉通X-100是一种非离子表面活性剂，在水中不解离,在溶液中稳定性高，不易受强电解质无机盐类的影响，能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成可溶性复合物；疏水端也能与膜蛋白的疏水区结合形成复合物，溶解于溶液中。异硫氰酸胍（GITC）：强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导至细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。GITC也是经典RNA提取试剂TRIZOL的主要成分。乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种优良的钙、镁离子螯合剂。抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）。Tris-Hcl：三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与盐酸混匀后形成的缓冲剂，为裂解液及核酸提供一个比较适宜的环境。小结：经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。