通过基因重组制备的抗体片段(Fab)等低分子抗体,与完整抗体相比,其分子尺寸更小,具有易扩散、渗透性强,以及不会与Fc受体产生相互作用、副作用小等优点。并且,可以利用大肠杆菌、CHO细胞等获得高浓度、高表达的抗体片段,因此在抗体药物、诊断用药的应用上备受关注。
一般来讲,低分子抗体的纯化工艺第一步捕获(Capture)步骤推荐使用Protein L亲和层析(AFC),其后接离子交换层析(IEC)等进行精纯。下面介绍几个以Protein L为配基的亲和填料分离纯化低分子抗体的相关文献。
● 抗体的基本结构及分离抗体时使用的亲和层析配基
抗体结构 | 结合部位 | AFC配基 | 目标纯化物 | ||
H链 | VH (VH3) | Protein A | IgG, Fab, F(ab')2, scFv, VH domain | ||
CH1 | Protein G | IgG, Fab, minibody | |||
抗体片段 | |||||
CH2 (-CH3; Fc) | Protein A | IgG, Fc fusion protein | |||
Protein G | |||||
CH3 | 抗体片段 | ||||
Fc; N-glycan | Fc受体 | ||||
L链 | VL | Protein L | Fab, F(ab')2, scFv, diabody, minibody, VL domain, dAb | ||
CL | (Kappa) (Lambda) | 抗体片段 | Fab, F(ab')2, scFv, diabody, minibody, dAb |
(纯化工艺示例) | 培养上清(Fab) (大肠杆菌、CHO细胞等) | (候选填料例) TOYOPEARL AF-rProtein L-650F (TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F) (其他Protein G或抗体特异性AFC填料) TOYOPEARL Sulfate-650F TOYOPEARL GigaCap S-650M TOYOPEARL MX-Trp-650M (MXC) TOYOPEARL NH2-750F TOYOPEARL GigaCap Q-650M (其他疏水层析填料等) | |
预处理(离心等) | |||
Protein L亲和层析 | |||
IEC (阳离子交换层析) | |||
IEC (FT; Flow-through)等 (阴离子交换层析) |
● 使用Protein L亲和层析等填料从大肠杆菌、CHO细胞中纯化低分子抗体的相关文献
● 从大肠杆菌中分离纯化重组Fab和相关杂质的示例(文献No. 1)
(要点)
• 确立了大肠杆菌表达的重组低分子抗体(Fab)的纯化方法,并对相关杂质进行了分离和识别(表征)。
• 通过使用Protein L亲和层析、Protein G亲和层析及阳离子交换层析的三步层析法(自动化),对4种重组Fab进行纯化,再做质谱分析。
• 识别出纯化产物中的Fab异构体、Fab相关杂质的L链(LC)以及L链的低分子片段(LMW)。
• 自动化Fab纯化及分析法的确立,让生产菌株及培养条件的优化变得容易。
● 使用Protein L亲和层析从大肠杆菌分离纯化重组Fab及相关杂质的示例(出自文献1)
使用TOYOPEARL AF-rProtein L-650F,有效分离出目标物质Fab,以及产品相关杂质的L链(LC)和LC低分子片段(LMW)。
Ref.: C. Schimek et al., Three-dimensional chromatography for purification and characterization of antibody fragments and related impurities from Escherichia coli crude extracts,
J. Chromatography A, available on line November 13, 2020, 461702, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461702
● Protein L亲和填料和筛选用预装柱产品一览表
货号 | 产品名称 | 粒径 (μm) | 包装** (mL) | 备注 |
0023486 | TOYOPEARL AF-rProtein L-650F | 30 - 60 | 10 | 散装填料(瓶) |
0045200 | SkillPak TOYOPEARL AF-rProtein L-650F | 30 - 60 | 1 mL×1支 | 预装柱 |
0045221 | SkillPak TOYOPEARL AF-rProtein L-650F | 30 - 60 | 1 mL×5支 | 预装柱 |
0045257 | SkillPak TOYOPEARL AF-rProtein L-650F | 30 - 60 | 5 mL×1支 | 预装柱 |
0045228 | SkillPak Antibody (TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, AF-rProtein L-650F, NH2-750F, Sulfate-650F, GigaCap Q-650M, GigaCap S-650S) | - | 1 mL×6种×1支 | 预装柱 |
0045229 | SkillPak mAb Platform (TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, NH2-750F, Sulfate-650F) | - | 1 mL×3种×2支 | 预装柱 |
0045232 | SkillPak Best-in-Class (Ca++Pure-HA*, TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, AF-rProtein L-650F, NH2-750F, Sulfate-650F) | - | 1 mL×5种×1支 | 预装柱 |
* Ca++Pure-HA是美国制造的产品,受美国相关出口法令管辖。
**填料有不同粒径和不同包装规格的产品。
SkillPak分为1 mL预装柱(7 mm I.D.×2.5 cm)和5 mL预装柱(8 mm I.D.×10 cm)。
【1 mL预装柱】
进口:使用“货号0017955 拉紧螺栓型(带包头)”,不可使用“货号0016566 便携式接头·1/16"(PEEK)”。
出口:可直接连接内螺纹接头,连接外螺纹接头时需使用管套(“货号0017898 拉紧螺栓型管套”)等配件。
【5 mL预装柱】
进口和出口:使用“货号0016566 便携式接头·1/16"”或“货号0017955 拉紧螺栓型(带包头)”。
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