中药有效组分配伍调控p38MAPK通路改善糖尿病心肌病的机理研究（信裕生物文献）

中药有效组分配伍调控p38MAPK通路改善糖尿病心肌病的机理研究（信裕生物文献）

相田园

中国中医科学院

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摘要：糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy, DCM)是一种独立的心肌疾病,每年约有2%-3%的糖尿病患者并发心血管病变。调查研究显示：65-74岁老年组的糖尿病患者,每年因并发心肌病而致死的男性、女性分别为4.9%、3.2%,而非糖尿病患者分别为1.9%、0.9%,两组存在显著的差异。随着DCM病程的进展,患者发生心衰和再梗死的风险增高,预后也很差,高患病率、致残率、病死率等也导致患者身心健康受到严重的损害,为个人和社会带来沉重的负担。据WHO报道,2010年全世界防治糖尿病的医疗卫生费用高达11.6%,2005-2015年中国用于糖尿病及相关血管疾病防治的费用达到5577亿美元。DCM发病机制复杂,涉及晚期糖基化终末产物途径、氧化应激损伤、脂质代谢紊乱、炎症反应、心肌细胞代谢障碍、心肌微血.管病变、自主神经病变等多个方面。目前缺乏明确的诊断标准,医师需要结合患者的临床症状、实验室检测、影像学检查、心肌活检等方法,在排除冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病、高血压及其它心肌病的基础上做出综合判断。其临床特征,早期主要以心脏舒张功能不全为主、易发生充血性心力衰竭；后期出现心脏收缩功能不全、心律失常、心肌广泛性坏死灶,最终进展为心源性休克、心力衰竭,重症患者甚至猝死。病理切片显示：内皮及内皮下纤维增生、基膜增厚、弥漫性心肌壁内微血管病变、毛细血管密度降低、心肌肥厚等。鉴于DCM对于患者和社会造成的巨大危害,探索其发病机制,找到有效的治疗方法成为科研工作者亟待解决的问题。西医治疗主要是对症治疗为主,辅以纠正代谢紊乱,延缓心律失常、心肌梗死、心衰及其他心血管并发症的发生。治疗方面,一是强化控制血糖的治疗；二是调脂治疗,改善脂质代谢紊乱。三是RASS拮抗剂的应用,如ACEI、ARB及利尿剂在不同的位点阻断RASS系统,不但起到了抑制心肌重构的作用,而且在改善心肌纤维化方面也有重要的意义。四是应用蛋白非酶糖基化的阻滞剂；五是改善心功能不全、心律失常、心衰等症状的药物和非药物治疗。中医理论认为本病气阴不足为本,瘀血阻络为标,各医家临床辨证论治依此为基础,思路见仁见智,或辨证结合辨病；或辨病论治,以一方为主,随证加减；或以其中一种治法为主,随证加减用药。近年逐渐进行深入的临床和基础研究,如中药验方、复方制剂、单味中药及其提取物、天然药物研发等,逐步改善患者的症状并提高生存质量,综合治疗仍然是基本原则。中药有效组分配伍(简称中药组分)具有多靶效应、便于定量分析、整体治疗的优势,为有效治疗DCM提供了新的思路。目的 本研究在既往研究中药组分(40%麦冬多糖、30%黄连生物碱、30%三七总皂苷)能够干预蛋白非酶糖基化的基础上,进一步观察其对DCM兔血糖相关指标：GIU、FBG、GHB、GSP、INS、IRI、FRA、AR;血脂相关指标TC、TG、HDL-C、 LDL-C;肝肾功能指标：ALT、AST、Sci、BUN;氧化应激相关指标：AGEs、NO、 MDA、SOD、GSH-Px;炎症反应相关指标：hs-CRP、IL-6、TNF-α、TGF-β1、bFGF、 PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、ET;凋亡相关指标：Caspase-3、bcl-2、AI;以及TGF-β1-p38MAPK-CREB信号转导通路的蛋白表达的影响；从而探讨中药组分对p38MAPK信号转导通路调控下心肌组织细胞增殖、分化、凋亡的影响,为其治疗糖尿病心肌病的可能作用机制及新靶点提供依据。方法实验用兔70只,按随机数字表选取10只作为空白对照组,喂养普通饲料,第4周末,耳缘静脉推注0.9%氯化钠注射液5ml,再普通饲料喂养8周。其余60只大兔喂养含2%胆固醇、0.5%胆酸和5%猪油的高脂饲料30g/(kg·d),第4周末禁食8小时,造模前称取体重,按照100mg/kgBW剂量,耳缘静脉推注0.9%氯化钠注射液配制的5%四氧嘧啶。第8周测空腹血糖(FBG),选取三次均在16.7mmol/L-23.5mmol/L大兔,不符合上述FBG标准者剔除,继续高脂饲料喂养4周。第12周末,随机选取空白对照组大兔1只,造模组大兔2只麻醉后取材,观察心肌病理组织显示：与空白组比较,造模组大兔心肌细胞肿胀变性,水肿明显,细胞质内形成大量的空泡,心肌间质纤维结构紊乱,细胞间界限不清,间隙增宽,血管周围基质增多,间质出现炎性细胞浸润、核裂解、固缩以及核丢失现象,表明糖尿病心肌病模型已经建立。造模成功50只大兔,按照空腹血糖水平、体重均衡原则分组为：①模型对照组10只②中药组分高剂量组10只③中药组分中剂量组10只④中药组分低剂量组10只⑤辛伐他汀对照组10只。第13周实验各组开始灌胃,用开口器撑开兔口,插入小儿胃管,检测进入胃部。具体剂量为：中药组分高剂量组450mg/(kg·d)、中药组分中剂量组150mg/(kg·d)、中药组分低剂量组50mg/(kg·d);辛伐他汀组0.8mg/(kg·d);空白对照组及模型对照组以10ml/(kg·d)生理盐水灌胃；2/日,连续上述药物灌胃8周。第20周末,取材前禁食不禁水12小时,5%戊巴比妥钠3ml/kg麻醉后取材。抽取腹主动脉血3-5ml,以Fresco离心机离心标本,3000r/m,15min,分离血清；摘取心脏,取部分左心室组织,用10%中性甲醛溶液固定,乙醇脱水,石蜡包埋,常规的切片操作,厚度为4um；剩余左心室组织,生理盐水冲洗,锡纸包裹,放入液氮速冻3min,放入-70℃冰箱备用。应用比色法测定血清中GLU、FBG、GHB、GSP、NO、NOS、MDA、SOD、 GSH-Px、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FRA含量；放射免疫法测定INS含量；使用上海信裕生物科技有限公司ELISA法测定血清中AGEs、ET、hs-CRP、IL-6、TNF-α、TGF-β1、bFGF、PDGF、PAI-1、 AR、ICAM-1、VCAM-1及心肌组织中Caspase-3、bcl-2含量。Western blotting法测心肌组织中TGF-β1-p38MAPK-CREB信号转导通路中相关蛋白的表达。HE染色后光镜下观察心肌细胞组织形态学、病理学改变。TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡并进行凝胶图像。结果(1)四氧嘧啶静脉注射配合高脂饲料喂养诱导的大兔,第4周造模,第8周时空腹血糖平均为18.0mmol/L,显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01),表明糖尿病模型建立。造模后继续配合高脂饲料喂养,第12周时造模组大兔心肌组织病理切片显示,细胞质内有大量的空泡形成,细胞肿胀,炎性细胞浸润、核裂解、固缩以及丢失,心肌间质纤维结构紊乱,基底膜增厚等,表明糖尿病心肌病模型已经建立。(2)中药组分对血糖相关指标的影响：第8周时造模组FBG显著升高,与空白对照组比较有显著差异(P<0.01)。灌胃给药后,第16周时高剂量组对DCM模型兔的FBG有降低作用,显著低于模型组(P<0.01)；第20周时,高、中、低剂量组对FBG均有降低作用,显著低于模型组(P<0.05)；而辛伐他汀组对DCM模型兔的FBG没有明显降低作用(P>0.05)。第20周进行糖负荷实验,以25%的葡萄糖(5g/kg)灌胃,分别检测0min、30mim、60min、120min、180min的血糖值,高、中剂量组对于灌胃糖负荷后30mim、60min、120min、180min血糖值均有降低作用,与模型组比较有显著的统计学差异(P<0.01);低剂量组对糖负荷后30min血糖有降低作用,与模型组比较有显著的统计学差异(P<0.05)。此外,高、中剂量组可明显降低GSP、AR、FRA、IRI、INS含量,与模型组比较,差异显著有统计学意义(P<0.05)。(3)中药组分对血脂相关指标的影响：造模后,模型组TC、TG、LDL-C均高于空白组,HDL-C低于于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组及辛伐他汀组对TC、TG、 LDL-C均有降低作用,对HDL-C有升高作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组降低了TC、LDL-C,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(4)中药组分对氧化应激指标的影响：模型组AGEs、MDA、NO、NOS均高于空白组,SOD、GSH-Px低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组、辛伐他汀组对MDA、NO、NOS有降低作用,对SOD、GSH-Px有升高作用；此外高、中剂量组对AGEs有抑制作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；低剂量组对NOS、AGEs有降低作用,对GSH-Px有升高作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(5)中药组分对炎症反应相关指标的影响：模型组hs-CRP、IL-6、ET、PDGF、 ICAM-1、VCAM-1、PAI-1均高于空白组,bFGF低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组、辛伐他汀组对hs-CRP、IL-6、 ET、PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1有降低作用,对bFGF有升高作用；此外高剂量组对TGF-β1、TNF-α有降低作用,而辛伐他汀组对TNF-α有降低作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组对hs-CRP、VCAM-1、PAI-1有降低作用,对bFGF有升高作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(6)中药组分对心肌组织TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达的影响：模型组TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达均高于空白对照组,有显著统计学差异(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时中药组分高、中剂量组及辛伐他汀组对TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达均有抑制作用,与模型组比较,有显著统计学差异(P<0.01),其中对p-CREB蛋白表达抑制最为明显,治疗后与空白组比较,没有显著统计学差异((P>0.05)。低剂量组对p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达有抑制作用,与模型组比较,有显著统计学差异(P<0.01),其中对p-CREB蛋白表达抑制更为明显,与空白组比较,没有显著统计学差异(P>0.05)。(7)中药组分对心肌组织病理的影响：模型组LVW、HW、H/W、LVWI均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组及辛伐他汀组对LVW、HW、H/W、LVWI有降低作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组Caspase-3、AI均高于空白组,bcl-2低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。中药组分高、中剂量组及辛伐他汀组对Caspase-3、AI有抑制作用,对bcl-2上调作用；低剂量组仅对bcl-2上调作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(8)中药组分对体重的影响：造模成功后,第12周时分组,各组之间体重无明显差异(P>0.05),表明分组均衡；而与空白对照组比较体重下降,有显著差异(P<0.05)。灌胃给药后,第16周时高剂量组与模型组比较,体重上升,差异有统计学意义(P<0.05)。第20周时高、中剂量组及辛伐他汀组与模型组比较,体重明显上升,差异显著有统计学意义(P<0.01)。(9)中药组分对肝肾功相关指标影响：造模后,模型组ALT、AST、BUN、Scr均高于空白对照组(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组对ALT、AST、 BUN、Scr均有降低作用,显著低于模型组(P<0.01)；辛伐他汀组对BUN、Scr均有降低作用,与模型组比较有明显统计学差异(P<0.01)。结论(1)四氧嘧啶静脉注射配合高脂喂养诱导的大兔模型,造模后,第8周时造模组空腹血糖平均为18.0mmol/L,表明糖尿病模型建立。造模后继续配合高脂饲料喂养,第12周糖尿病心肌病模型建立。(2)中药配伍组分可明显降低FBG、GHB、GSP、AR、FRA含量,降低空腹血糖,改善糖耐量异常；降低IRI、INS含量,改善胰岛素抵抗。(3)中药配伍组分可降低TC、TG、LDL-C、升高HDL-C,调整血脂紊乱。(4)中药配伍组分可降低AGEs、MDA、NO、NOS、升高SOD、GSH-Px含量,改善氧化应激损伤。(5)中药配伍组分可降低降低hs-CRP、IL-6、TNF-α、ET、TGF-β1、PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1,升高bFGF,缓解炎症反应。(6)中药组分通过调控p38MAPK/Caspase-3、bcl-2途径,有效抑制了心肌细胞凋亡；通过调控TGF-β1-p38MAPK-CREB信号转导通路,抑制了心肌组织异常细胞增殖、分化等的生物学效应,有效地缓解了心肌肥大、间质纤维化等病变的进程。(7)中药配伍组分减轻DCM兔全心重及左心室重量,可降低左心室重量指数及心体比。(8)中药配伍组分可明显增加DCM兔体重。(9)中药组分对ALT、AST、BUN、Scr均有降低作用。 还原

关键词：中药有效组分配伍; p38MAPK信号转导通路; 糖尿病心肌病; 机理研究;

导师：高普;

分类号：R285