低氧诱导成骨细胞增殖分化两种机制的研究（信裕生物文献）

低氧诱导成骨细胞增殖分化两种机制的研究（信裕生物文献）

李强

南方医科大学

摘要：研究背景随着我国经济和人民生活水平提高,交通意外伤及建筑工人意外导致的骨折发病率逐年递增,各种类型的骨折其治疗方式不尽相同,但最终治疗的目的为恢复骨折断端的连续性和骨的稳定性。影响骨折愈合的因素很多,例如特殊部位的骨折或严重的开放性骨折,通常会伴随骨折断端血管及神经的副损伤,在骨折修复过程中,骨折断端周围的缺血、缺氧和周围组织的炎症反应,均会影响骨折愈合的时间和程度,临床也经常出现骨折断端周围环境缺氧和炎症反应而未及时处理导致骨折愈合不良,延迟愈合或者是骨折不愈合,不但会给患者带来不必要的痛苦,也会给社会和家庭带来巨大的经济负担,因此,研究骨折不愈合的因素,如何人为地从外界通过药物或手术干扰促进骨折愈合成为临床急需解决的问题。通常状态下,骨折断端周围血管的损伤或者是新生骨痂周围血管再生被抑制,均会导致断端缺血缺氧,从而抑制骨折愈合；而在缺氧环境下骨折断端周围释放的缺氧诱导因子、血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白等可以促进骨折愈合。有研究通过骨折固定术后周围组织注射血管内皮生长因子来提高骨折愈合的比率,但由于血管内皮细胞生长因子价格昂贵,或者还需要其他疗法的参与,因此难以在临床中实施。另外有研究发现,严重创伤会导致局部或全身的炎症反应。而在创伤愈合与骨折愈合过程中各种免疫细胞激活,细胞因子被释放,激活的细胞和释放的因子均参与到骨折愈合的各个阶段,在骨折愈合的早期,免疫细胞就已经开始渗入到骨折断端血肿内。在骨折早期,缺氧就可以导致白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、使用上海信裕生物科技有限公司转化生长因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)上调,从而调节骨折断端周围的微环境。但是对于骨折愈合过程中的炎症反应机制目前尚不清楚。研究表明,在全身败血症动物模型中,高迁移组蛋白B1 (high mobility group box-1 protein, HMGB1)是最早被确认的缺氧类因子。至今学术界认为,高迁移率族蛋白B1是多种损伤模型例如肺损伤、肝脏局部缺血再灌注、失血性休克等关键的炎症因子,高迁移率族蛋白B1与Toll样受体(toll-like family of receptors, TLRs)结合启动损伤最初的炎症反应,然而对于高迁移率族蛋白B1在骨折愈合中对于炎症反应的应答作用机制尚不清楚。另外骨形态发生蛋白尤其是骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨钙蛋白可以在一定程度上缓解低氧对于骨间充质干细胞修复骨折的影响,但是长期的缺氧将会导致成骨细胞和骨间充质干细胞的凋亡甚至坏死。此外许多研究表明,N-甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)是在医疗器械上使用的安全的具有生物活性药物,尤其是近年来有报道,在体内,N-甲基吡咯烷酮对于兔颅骨损伤具有一定的促进骨化和修复的作用,因此N-甲基吡咯烷酮可能对骨质疏松、骨折愈合或者其他骨量丢失的疾病具有一定的疗效。也有研究表明,N-甲基吡咯烷酮具有一定的抗炎作用,其能与脂多糖结合抑制炎症过程。N-甲基吡咯烷酮能够抑制炎症中脂多糖导致的TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS和COX-2等炎症因子的生成,其主要是通过降低NF-κ B信号途径发挥抑制炎症因子生成的作用。因此本文分别通过两个方面研究缺氧状态下可能影响骨折愈合的信号通路,首先我们通过在缺氧状态下骨折断端血肿细胞中和巨噬细胞检测高迁移率族蛋白B1水平,并研究高迁移率族蛋白B1在常氧和缺氧环境中如何激发Toll样受体的信号过程促进成骨细胞中的增殖规律。同时我们对在常氧和缺氧环境下检测了成骨细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinsaes. ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化,并将xx-特异性的siRNA转染到缺氧环境中的成骨细胞,并用高迁移率族蛋白B1干扰,检测了细胞增殖特性和ERK/JNK的磷酸化。研究的第一部分主要探讨低氧下,通过TLR-4信号通路高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)影响ERK/JNK磷酸化和成骨细胞分化增殖的机制。第二部分我们要研究N-甲基吡咯烷酮在低氧环境下对成骨细胞凋亡和分化的作用,并且从分子水平分析N-甲基吡咯烷酮对成骨细胞作用的相关机制,本文的成果可能解释N-甲基吡咯烷酮可能促进低氧环境中成骨细胞增殖分化修复骨折的能力,也为探索骨折不愈合的机制,研制治疗骨不连的药物提供分子生物学基础。研究目的1、探讨低氧下,通过TLR-4信号通路高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)影响ERK/JNK磷酸化和成骨细胞分化增殖的机制,为临床骨不连的治疗提供分子生物学基础理论。2、探讨低氧下,通过NF-κB信号通路N-甲基吡咯烷酮(NMP)影响成骨细胞分化的机制,为N-甲基吡咯烷酮的临床应用提供分子生物学基础。研究方法第一部分：1.样本的制备及分组选自2014年3月至2015年3月来自于内蒙古医科大学附属医院骨科31例股骨干骨折病例,在手术前经患者签署知情同意书,经内蒙古医科大学附属医院医学伦理委员会伦理审核后,在手术中获取骨折周围血肿样本和新鲜血液样本。在RPMI-1640培养基中培养组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞,并在培养中加入10%或2%的小牛血清,50μg/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素,先对细胞进行离心分离按照1-2×105活细胞/mL再悬浮,每三到四天更换新的培养液(依据细胞生长的密度)。在RPMI-1640培养基中培养MG-63细胞,并在培养中加入10%的小牛血清,50μg/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素,将两类细胞在5%CO2,在37℃的环境下放置于细胞培养皿上。低氧环境造模方法,将细胞在5%CO2和氮气及2%的氧气混合气体中培养。在高迁移率族蛋白B1检测试验中,将组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞放置于常氧和低氧环境中培养8,12和24小时,然后将悬浮组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞收集,并进行高迁移率族蛋白B1的检测。在RPMI-1640 (2% FBS)上培养85-95%细胞融合度的MG-63细胞,在常氧和低氧环境下混合0,0.2或者1μg/mL高迁移率族蛋白B1培养24,48和72小时；将siRNA-TLR-4和control siRNA混有30和60 nM脂质体2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)转染MG-63细胞造模敲除MG-63细胞的TLR-4。2.高迁移率族蛋白B1的酶联免疫吸附试验为了检测骨折断端血肿样本和新鲜血液样本中以及巨噬细胞U937的高迁移率族蛋白B1的水平,按照酶联免疫吸附试验说明书的步骤进行操作检测,实验板孔中连续滴加100μL标准液和样本,并在37℃环境下孵育2小时,然后吹吸样本,然后用100μ混有PBST的磷酸盐溶液冲洗四次,然后将100μL高迁移率族蛋白B1抗体加入孔中,37摄氏度下孵育一小时,冲洗四次,每孔再加入100μL螯合有辣根过氧化物酶的二抗37摄氏度下孵育30分钟,在黑暗环境下每孔加入100μL的终止液并放置15分钟,封板后在450nm酶标仪中测量数据。3.mRNA的提取和定量分析MG-63的nRNA用TRizol reagent试剂盒进行提取,mRNA的含量用实时定量PCR仪进行测量,MG-63细胞中的ERK,JNK, TLR-Tubulin的mRNA含量用SYBR Green PCR Kits试剂盒进行定量检测,定量聚合酶链反应(quantitativepolymerase chain reaction, qPCR)过程在ABI PRISM 7300检测系统中进行,引物链是由上海生工公司合成,所有的检测都是利用AACt方法,检测结果都是待检物和内参比较的倍数。4.免疫印迹实验利用NE-PER细胞核和细胞质抽提检测试剂盒抽提细胞溶质和细胞核蛋白,利用蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂盒进行蛋白增补,10%或12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样本,再将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜,然后将膜用2%BSA封闭,4摄氏度下过夜,然后转移到非特异性结合膜,用兔多克隆IgG结合高迁移率族蛋白B1、ERK磷酸化或非磷酸化Thr202/Thr204, JNK磷酸化或非磷酸化Thr183,TLR-4和微管蛋白,用电化学发光法检测特异性结合,高迁移率族蛋白B1或TLR-4的含量水平用相对于微管蛋白的灰度值表示,p-ERK或p-JNK的结果用相对于ERK、JNK的灰度值表示。5.CCK-8的细胞增殖实验MG-63在常氧和缺氧环境下的增殖测量,以及MG-63细胞在高迁移率族蛋白B1处理或未处理,或者MG-63细胞转染siRNA-TLR-4和siRNA-Con的增殖测量都用CCK-8实验的方法测量。其测量方法简言之,就是每组MG-63细胞与CCK-8共培养,在490nm,检测各类样本的吸光度。第二部分：1.细胞培养人类成骨细胞hFOB 1.19在1：1混合Ham’s F12的基质和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)培养液中培养,培养液中添加2.5 mM左旋谷酰胺和0.3mg/ml G418 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA),并且添加10%小牛血清hFOB 1.19细胞在5% CO2,37℃环境下温箱中培养。低氧环境造模方法,将细胞在5% CO2和氮气2%的氧气混合气体中培养。持续监测氧的浓度,N-甲基吡咯烷酮分别配成0,3,10和30 mM浓度的溶液与成骨细胞混合。2.酶联免疫吸附试验检测BMP-2, PINP, ALP和RUNX-2检测人类成骨细胞hFOB 1.19 cells中细胞内的骨形态发生蛋白-2,骨胶原前肽I(propeptide of type I procollagen I, PINP)、碱性磷酸酶和成骨细胞转录因子-2(Runt-related transcription factor-2, RUNX-2)表达水平采用酶联免疫吸附试验检测,全部检测步骤参照相应的试剂说明书。培养板上对照孔连续滴加100μL标准液和hFOB 1.19细胞,4℃下过夜培养。然后将培养盘中滴加100μL抗体溶液(抗BMP2, PINP, ALP和RUNX2),37℃下培养1小时,然后加入100μL辣根过氧化物酶二抗37℃下培养半小时,在每次孵育前,用添加PBST的磷酸盐缓冲剂清洗培养板四次,最后在培养板上滴加100 μL终止液,暗室中放置15分,在450 nm下用分光光度计检测其浓度。3.利用RT-qPCR法检测p65 mRNA,用荧光素酶报告实验检测NF-κB依据产品说明书,用Total Nucleic Acid Isolation Kit试剂盒提取hFOB 1.19的mRNA,最后添加1μl RNasin(?) Plus RNase的终止液,用Takara One Step RT-PCT kit检测p65 mRNA的含量,通过p65-特异性引物(正：5’-tgatcactaagcaggaagatgtg-3’,反：5’-gaaggctcaggtcggccccag-31).利用AACt法定量测量p65比β-actin的相对量ohFOB 1.19细胞移植到96孔培养板,培养至85%细胞融合度,hFOB 1.19细胞用NF-κB荧光素酶转染,依据Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)检测系统的说明书检测转染后的NF-κB的浓度。4.蛋白分离和免疫印迹实验利用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit试剂盒,参照其说明书对5×105 hFOB1.19细胞进行蛋白提取,分别对细胞核和细胞质中的溶解物进行提取,并加入蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),用 BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)试剂盒定量检测细胞核和细胞质中溶解物。利用12% SDS-PAGE梯度凝胶分离待检蛋白p65和IκB,然后转膜到硝酸纤维膜上,为了阻断特异性结合部位,用兔多克隆抗体与p65, IκB和内参β-actin结合,2%BSA孵育硝酸纤维素膜(4℃过夜),然后辣根过氧化物酶偶联二抗羊抗兔抗体室温下进行孵育1小时,每次孵育前都要用l×磷酸Phosphate Buffered Saline Tween-20 (PBST)冲洗三次,p65, IκB和β-actin蛋白含量用增强化学免疫荧光法进行检测。5.MTT法检测细胞活力用MTT法检测hFOB 1.19细胞活力,以下简单描述MTT法,hFOB 1.19细胞在常氧,低氧及合并N-甲基吡咯烷酮的作用下与MTT试剂37℃下孵育3小时,在450 nm下用分光光度计测量其浓度,结果用OD450值表示。统计分析全部数据以均数±标准差表示,采用SPSS18.0统计学软件进行统计学分析,两组间比较采用t检验,检验水准设置为0.05,当P<0.05时两组间差异具有统计学意义。实验结果第一部分：1.在低氧环境中骨折断端血肿标本、巨噬细胞U937中高迁移率族蛋白B1含量上调。为了研究在骨折过程中高迁移率族蛋白B1的作用,我们首先在骨折断端血肿中检测了高迁移率族蛋白B1的含量,其中骨折断端血肿标本来源于临床股骨干骨折的手术治疗患者,另外我们选取了相同病患的新鲜血液标本作为对照组,结果骨折断端血肿标本中高迁移率族蛋白B1的含量为(31.730±3.197)ng/mL,远高于新鲜血液标本中高迁移率族蛋白B1的含量(9.845±0.967 ng/mL),经检验P<0.0001,差异具有统计学意义。接着我们研究了缺氧下人类巨噬细胞中高迁移率族蛋白B1的含量,其中巨噬细胞是高迁移率族蛋白B1的主要来源细胞。缺氧处理12小时到48小时,与相同时间常氧状态下比较,U937巨噬细胞高迁移率族蛋白B1的水平上调。同时我们也测量了U937细胞在常氧和缺氧环境下细胞核和细胞质中高迁移率族蛋白B1的分布,细胞核中的高迁移率族蛋白B1在常氧和缺氧环境中无差异,然而,在细胞质中,缺氧环境下,高迁移率族蛋白B1的含量上调。在缺氧环境下培养24和48小时,细胞质/细胞核中的高迁移率族蛋白B1的比值上调,差异具有统计学意义。2.高迁移率族蛋白B1促进成骨细胞MG-63增殖并且上调TLR-4。将0、0.2和1μg/mL三种浓度的高迁移率族蛋白B1加入MG-63的培养皿,检测其生长曲线。我们发现,在常氧环境下,0.2μg/mL的高迁移率族蛋白B1可以使MG-63细胞增殖水平增高,而1μg/mL高迁移率族蛋白B1促进MG-63细胞增殖水平最高,以上研究均说明,在常氧环境下高迁移率族蛋白B1对于MG-63具有促进其增殖的作用,同样在缺氧环境中高迁移率族蛋白B1对于MG-63也具有促进其增殖的作用,差异有统计学意义(见图1-5,表1-3)。0.2μg/mL高迁移率族蛋白B1处理MG-63细胞24,48,72小时后,可以显著性的抑制该细胞的活性下降。同时我们检测了在常氧和缺氧状态下高迁移率族蛋白B1干扰MG-63细胞中TLR-4的水平。免疫印迹反应结果显示,特别是在对MG-63细胞施以0.2μg/mL高迁移率族蛋白B1干扰后,在缺氧状态下MG-63细胞中TLR-4水平显著性提高。因此在缺氧状态下,高迁移率族蛋白B1可以促进MG-63细胞的增殖,并且使TLR-4水平上调。3.高迁移率族蛋白B1诱导MG-63细胞中ERK和JNK的磷酸化。在常氧和缺氧状态下利用高迁移率族蛋白B1干扰MG-63细胞后测量ERK和JNK的磷酸化和表达水平。在缺氧环境下培养MG-63细胞12小时后,ERK的mRNA水平显著性增高,高迁移率族蛋白B1(0.2μg/mL)干扰还会促使ERK的mRNA水平进一步增高,且增高水平持续到干扰后24小时。在缺氧环境下培养MG-63细胞12小时后,JNK的mRNA水平显著性增高。缺氧处理MG-63后ERK和JNK的磷酸化水平显著性升高,组间差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。且缺氧处理MG-63并用高迁移率族蛋白B1干扰后,ERK和JNK的磷酸化水平还会继续升高,差异具有统计学意义。(p<0.01)。以上研究结果说明高迁移率族蛋白B1诱导MG-63细胞中ERK和JNK表达水平增加和磷酸化。4.MG-63细胞TLR-4低表达后可以抑制高迁移率族蛋白B1促进MG-63细胞增殖的作用。利用TLR-4-特意的siRNA在常氧环境下使MG-63细胞的TLR-4的表达沉默,用30或60 nM siRNA-TLR-4对MG-63细胞进行敲除,两组的TLR-4 mRNA水平从分别从(1.00±0.12)和(1.00±0.13)降到(0.53±0.058)和(0.32±0.037),均为p<0.01,差异具有统计学意义(见图1-13)。另外与对照组siRNA-Con相比较,siRNA-TLR-4转染MG-63细胞后置于缺氧环境中24、48小时会明显抑制MG-63中TLR-4的表达生成(p<0.05或p<0.01)。然后用60 nM siRNA-TLR-4和siRNA-Con转染MG-63细胞后置于缺氧和常氧环境下,我们绘制MG-63细胞的生长曲线。结果显示与对照组siRNA-Con相比较, siRNA-TLR-4转染MG-63细胞后在常氧环境中24、48、72小时会明显抑制MG-63细胞的增殖水平(p<0.05或p<0.01,见图1-15)。另外与对照组siRNA-Con相比较,siRNA-TLR-4转染MG-63细胞后会明显降低MG-63细胞的活性(p<0.05或p<0.01,见图1-16)。综上所述,高迁移率族蛋白B1在常氧环境下促进MG-63细胞增殖的作用依赖TLR-4,或者说高迁移率族蛋白B1可以介导提高在低氧环境下MG-63的细胞活力。5.TLR-4低表达后降低了MG-63细胞中,高迁移率族蛋白B1-诱导的ERK和JNK磷酸化。通过免疫印迹实验检测通过60 nM siRNA-TLR-4和对照组siRNA-Con转染的MG-63细胞中ERK和JNK磷酸化水平。与对照组siRNA-Con相比,转染siRNA-TLR-4后24或48小时,可以显著地抑制低氧诱导的ERK磷酸化(p<0.01),差异具有统计学意义。同样转染60 nM siRNA-TLR-4后,可以显著地抑制低氧诱导的JNK磷酸化(p<0.01),差异具有统计学意义。因此我们认为,低氧环境下,TLR-4的低表达降低了MG-63细胞中高迁移率族蛋白B1-诱导的ERK和JNK磷酸化水平。第二部分：1.低氧诱导成骨细胞分化标志蛋白下调骨形态发生蛋白-2、骨胶原前肽Ⅰ,碱性磷酸酶和RUNX2蛋白的高表达是成骨细胞分化增殖的特征性标志。为了验证以上结果,我们首先利用酶联免疫吸附试验测量在常氧和低氧状态下hFOB 1.19细胞中骨形态发生蛋白-2、骨胶原前肽Ⅰ、碱性磷酸酶和RUNX2蛋白的表达情况。在hFOB 1.19细胞中,在各个时间段,缺氧环境中BMP-2的表达量显著性低于常氧状态(p<0.05或p<0.01处理后6,12或24小时)。缺氧环境中PINP、ALP、RUNX2的表达量显著地低于常氧状态(p<0.05或p<0.01处理后6、12或24小时)。2.低氧诱导的成骨细胞去分化激活NF-κB信号低氧能够在神经元、T淋巴细胞、小神经胶质细胞和各类的肿瘤细胞介导NF-κB通路。我们在常氧和低氧状态下培养hFOB 1.19细胞0、 6、12或24小时,通过在hFOB 1.19细胞内激活NF-κB通路,低氧环境中的hFOB 1.19细朐p65 mRNA表达水平增高(p<0.01或p<0.001)。免疫印迹技术定性分析实验也证明,低氧环境中处理hFOB 1.19细胞12或24小时后,hFOB 1.19细胞p65蛋白表达水平增高,差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。而NF-κB的阻滞剂IκB,在hFOB 1.19细胞中下调,差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。为了进一步证实低氧可以激活NF-κB通路,我们利用NF-κB荧光素酶检测NF-κB的活性状态,其中NF-κB荧光素酶含有四个NF-kB结合位(图2-9)。与常氧下hFOB 1.19细胞相比,低氧可以激活两倍量NF-kB荧光素酶(p<0.01或p<0.001),以上结果表明,低氧可以诱导p65的表达和激活。3.N-甲基吡咯烷酮影响低氧诱导的成骨细胞分化为研究N-甲基吡咯烷酮影响低氧诱导的成骨细胞分化的可能机制,我们同时检测了低氧环境中N-甲基吡咯烷酮处理过的hFOB 1.19细胞中BMP-2, PINP,ALP和RUNX2的含量。我们首先研究了在低氧和常氧环境下N-甲基吡咯烷酮对hFOB 1.19细胞活力的影响,在常氧环境下N-甲基吡咯烷酮对hFOB 1.19细胞活力无任何影响,而在低氧环境下N-甲基吡咯烷酮干扰hFOB 1.19细胞12、24小时后,可以减轻低氧对hFOB 1.19细胞活力的影响(p<0.05或p<0.01),组间差异具有统计学意义。N-甲基吡咯烷酮减轻低氧对hFOB 1.19细胞活力的影响成剂量依赖性。(p<0.05)接着我们用酶联免疫吸附试验研究了缺氧环境中N-甲基吡咯烷酮处理的hFOB 1.19细胞中BMP-2、PINP、ALP和RUNX-2蛋白表达水平。10 mM N-甲基吡咯烷酮处理hFOB 1.19细胞12或24小时后抑制了hFOB 1.19细胞中BMP-2的含量降低。同样10mM NMP处理hFOB 1.19细胞12或24小时后抑制了hFOB 1.19细胞中PINP的含量降低,经比较,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。同样N-甲基吡咯烷酮处理hFOB 1.19细胞6或24小时后也抑制了细胞中ALP和RUNX-2的含量降低(p<0.05或p<0.01)。综上所述,N-甲基吡咯烷酮抑制低氧诱导的成骨细胞分化减少和成骨细胞的活性下降。4.低氧下,N-甲基吡咯烷酮通过抑制NF-κB信号通路来调节hFOB 1.19细胞的分化。为了研究N-甲基吡咯烷酮对于影响低氧导致的成骨细胞分化降低的机制,我们重新检测在10 mMN-甲基吡咯烷酮干扰或未加10 mMN-甲基吡咯烷酮干扰情况下,低氧诱导的hFOB 1.19细胞中NF-κB信号通路激活状态。10 mMN-甲基吡咯烷酮干扰后,hFOB 1.19细胞中p65 mRNA的水平在低氧环境下显著地下降,其蛋白表达也是显著地下降,而hFOB 1.19细胞中IκB水平却显著地提高,(p<0.01或p<0.001),差异具有统计学意义。NF-κB荧光素酶实验证实,在低氧环境下,10 Mm NMP可抑制hFOB 1.19 cells中荧光素酶的活性(p<0.05或p<0.01)。N-甲基吡咯烷酮抑制在hFOB 1.19细胞中低氧诱导的NF-κB信号通路。结论1.在低氧环境中骨折断端血肿标本、巨噬细胞U937中高迁移率族蛋白B1含量上调2.高迁移率族蛋白B1促进成骨细胞MG-63增殖并且上调TLR-43.高迁移率族蛋白B1诱导MG-63细胞中ERK和JNK的磷酸化4.MG-63细胞TLR-4低表达后可以抑制高迁移率族蛋白B1促进MG-63细胞增殖的作用5.TLR-4低表达降低了MG-63细胞中高迁移率族蛋白B1-诱导的ERK和JNK磷酸化6.低氧诱导成骨细胞分化标志骨形态发生蛋白-2、骨胶原前肽Ⅰ,碱性磷酸酶和RUNX2蛋白下调7.低氧通过NF-κB信号通路诱导成骨细胞去分化激活8.N-甲基吡咯烷酮影响低氧诱导的成骨细胞分化9.低氧下,N-甲基吡咯烷酮通过抑制NF-κB信号通路来调节hFOB 1.19细胞的分化 还原

关键词：缺氧; 高迁移率族蛋白B1; 成骨细胞; 细胞分化; TLR信号通路; N-甲基吡咯烷酮; NF-κB信号通路;

导师：余斌;

分类号：R683