sci 文献解析揭示如何进行蛋白质转运研究

什么是蛋白质转运？

除了少量的蛋白质由线粒体和叶绿体 dna 编码外，其余蛋白质都是由细胞核 dna 编码，在细胞质游离/吸附的核糖体上合成。

细胞要发挥正常功能，必须使每一个蛋白质都要在膜（细胞膜，细胞器膜）或水相腔室（细胞质，细胞器基质或内膜腔）中正确定位。

如受体蛋白、离子通道蛋白和转运蛋白需要嵌在质膜内。dna、rna 聚合酶需要运送到核里。蛋白酶和过氧化氢酶应分别转运至溶酶体和过氧化物酶体。其他如细胞外间质和激素则需要分泌到细胞外。

也就是说蛋白质转运是

* 细胞内将新合成的蛋白分类，修饰并运输到正确目的地的过程。

* 可以将蛋白质转运形象化类比为街道上移动的交通工具：多方向运动，遵守交通规则，高度动态，每个都具有一个最终目的地。

* 蛋白质转运/蛋白质定位/蛋白质分发，这三个术语在文献中是可以互换的。 蛋白质转运主要有两条路径：内吞和外泌。

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为什么要研究蛋白质的转运？

* 帮助我们了解细胞稳态的关键机制，蛋白质-蛋白质相互作用，翻译后修饰和细胞间的相互作用。

* 解释人类疾病发病机理，如亚细胞蛋白质转运发生错误，将会发生「转运异常疾病」，目前为止，已经发现超过 30 种转运异常疾病，囊性纤维病是最具代表性之一。这些疾病包括但不仅限于代谢、神经病变和癌症疾病。

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如何研究蛋白质转运？

研究方法主要有以下几类

* 放射自显影（脉冲追踪 + 电子显微镜）

* 绿色荧光蛋白（gfp）+ 显微镜检查

* 突变体 + 绿色荧光蛋白（gfp）

* 生化分析和无细胞系统

* 亚细胞结构分离 + western，ip，交联质谱技术（xl-ms）

其中亚细胞结构分离 + western，ip，交联质谱技术（xl-ms）是目前最常用的方法。

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亚细胞结构分离方法研究蛋白转运应用举例

example a. ulbp2 trafficking blockage

leung wh., et al （2015）。 j. of immunol., spin column-based fractionation.

leung 等人[1]研究 prl-3 对 ulbp2 蛋白转运的影响。人结肠癌细胞系 hct116 使用 40um prl-3 处理，然后使用离心管柱法进行亚细胞结构分离。

结果显示，细胞质膜，细胞器和细胞浆组分被彻底分离，经过化学处理后的细胞导致 ulbp2 从细胞膜迁移到细胞器组分，而各组分中其他蛋白质在 prl-3 处理前后无明显变化。

example b. hiv gag protein trafficking

butluay et al cell. （2014）， spin column-based fractionation.

kutluay 等人[2]研究 hiv-1 病毒颗粒组装过程中 gag-rna 复合体的分布及变化情况。实验中关键步骤之一是证明在不同亚细胞结构中 gag-rna 复合体表现出不同形式。

用 hiv-1 病毒质粒转染 4su-fed 293t 细胞后，通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后的细胞浆和细胞膜组分进行 western 印迹和免疫沉淀实验。

结果表明，胞浆中的 gag 蛋白主要是单体形式，而细胞质膜上的 gag 蛋白是多聚体形式（图 b）。这一结论很大程度上取决于细胞浆和细胞质膜组分的彻底分离（图 a）。

example c. isolated plasma membrane shows clearer signals

kashiwagi y. et al. plos one （2015） , spin column-based fractionation.

大部分质膜蛋白为低丰度表达，没有经过分离和富集时很难检测和定量。上图数据[3]显示质膜蛋白富集后对灌注后小鼠心脏样品中 sglt1 检测效果的影响。与总膜部分相比，sglt1 和质膜蛋白内参 na+/k+ atpase 信号在质膜蛋白组分中都有显着的增强。

example d. distribution of target proteins

georgiou d. k. et al. jbc （2015）， spin-column-based fractionation.

georgiou 等人[4]研究钙离子通道复合物 cav1.1 调控脂肪酸转运蛋白 cd36 分布和脂肪酸代谢。cav1.1 e1014k 基因敲除小鼠（ek）和野生小鼠（wt）的肌肉组织样品，通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后的细胞浆，细胞核，细胞膜以及纯化的线粒体组分进行 western 印迹检测 cd36 的表达及分布情况。

lamin a，gapdh 及 vdac 分别为细胞核，细胞浆及线粒体组分的内参。结果表明，与 wt 相比，ek 小鼠的 cd36 在细胞浆组分中增加，在质膜组分中减少。其它膜蛋白（enos,cav1.1,ryr1）则无明显变化。

example e. cell fractionation and ip

devarakonda et al. bmc cancer （2015） 15:614, spin-column-based fractionation.

devarakonda 等人[5]研究乳腺癌患者细胞 hsp90 蛋白与重链抗体（hcab1 及 hcab2）靶向结合。乳腺癌样品通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后用细胞浆和细胞膜蛋白进行 ip 实验。

结果表明只有 hcab2 可在细胞浆中沉淀内源 hsp90 及重组蛋白（hsp90beta），hcab2 也可在细胞质膜中沉淀内源 hsp90。

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亚细胞结构分离的常用方法有哪些？

1. 蔗糖密度超高速离心分离法

传统方法进行亚细胞结构分离是通过蔗糖密度超高速离心分离[6,7]，操作方法十分繁琐和耗时并且需要较大样品量。 通常需要几个小时甚至几天才能完成。步骤复杂，需要特殊设备仪器，自配溶液，以及需要优良的操作技术。

2. 表面活性剂提取法

大部分商业试剂盒属于这类方法。可将细胞分为两大组分：胞浆蛋白和总膜蛋白，但无法单独提取质膜蛋白组分，下游无法进行蛋白互作类研究。

3. 离心管柱法亚细胞结构分离法

你可能不知道，离心管柱法是新一代的亚细胞结构分离技术。离心管柱法亚细胞结构分离无需匀浆仪和超高速离心机，简单而快速。

细胞/组织样品首先通过一个特制的离心管柱，在这个过程中细胞膜会被破裂，完整的细胞核，细胞器，质膜和胞浆蛋白被释放到溶液中，之后进一步分离成五个组分：细胞核，细胞浆，总膜，细胞器，质膜。

使用离心管柱和独特的缓冲系统配合，可以获得高回收率，低交叉污染的天然亚细胞结构蛋白，整个操作不到一小时即可完成。

分离出的天然亚细胞结构蛋白可以用于任何下游实验，离心管柱法也可用于植物样品亚细胞结构的分离。点击「阅读原文」即可了解更多相关内容。