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如何为甲基化特异 PCR 设计引物
如何为甲基化特异 pcr 设计引物
基因序列查找
一般的 pcr 所需序列可以在 ncbi gene 上，但是甲基化发挥作用主要在启动子区域，基因序列要包含第一外显子的上游碱基，所以查找基因序列可以用 ucsu 的 genome browser （http://genome.ucsc.edu/）。
点击 genomes 选择对应的染色体标本
输入基因名称
选择基因转录本
注意一个基因可能有多个转录本，在 refseq genes 里选择你要查找的序号。
查看基因序列
设置参数
点击 submit 便出现了外显子大写的的基因序列，可 copy 到 word 里保存供以后参考。
在线设计引物
利用甲基化设计的网站 meth primer （http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi1）粘贴基因序列。
粘贴基因序列
包含第一外显子和上游碱基的基因序列。
设置条件
查看结果
网站给出的几个参考的引物相差不大，可以根据自己的需要重新设置条件来重新设计。另外可以根据一些设计引物的原则来筛选合适的引物。我也整理了一些关于引物设计的原则，供参考。
网站给出的几个参考的引物相差不大，可以根据自己的需要重新设置条件来重新设计。另外可以根据一些设计引物的原则来筛选合适的引物。我也整理了一些关于引物设计的原则，供参考。
参考原则
确保目标序列中有非 cpg 的 c 的个数。
如果你没有足够的 c 位于非 cpg 内，那么未转化的 dna 和甲基化的 dna 看上去会差不多，以 6～7 个 cpg 为理想。如果低于这个，那么特异性会降低。你会得到非特异性的扩增，因为它区分度不够。
让产物短一点
亚硫酸氢盐转化的过程会损伤模板 dna，因此尝试扩增较小的片段（小于 150 bp），将得到最佳的结果。如果你通过电泳来运行产物，那么确保你能够将 m 引物的产物与 u 引物的分开。
遵守 pcr 的原则 pcr 引物设计的所有原则也适用于 msp。
1）引物的退火温度要相当，如果可以的话，将 m 引物和 u 引物设计成相同的条件，这样可同时运行。
2）引物之间不要形成二聚体，一般引物自身连续互补碱基不大于 3 bp。
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