开发出比CRISPR-Cas9更好的CRISPRi技术

上海信裕

2016/03/14 13:05

阅读：120

在一种新的研究中，来自美国格拉斯通研究所的研究人员将二十一世纪两种最为强大的工具结合在一起，首次利用改进的CRISPR-Cas9系统，修改了诱导性多能干细胞（iPSCs）基因组被读取的方式。相关研究结果于2016年3月10在线发表在Cell Stem Cell期刊上，论文标题为“CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs”。

在这项研究中，研究人员采用一种被称作CRISPRi（CRISPR interference, CRISPR干扰）的CRISPR改进版让iPSCs和源自iPSCs的心肌细胞中的基因失活。这种方法由当前这篇论文的共同作者Stanley Qi博士于2013年首次报道，它允许更加准确地和高效地沉默或者说关闭基因，从而显著地改进了CRISPR-Cas9系统。CRISPRi也可以灵活地逆转基因抑制和调整基因抑制程度。

标准的CRISPR系统利用蛋白Cas9在细胞DNA上进行切割，从而准确地删除基因组中的靶序列。基于这种系统的CRISPRi使用一种由两种蛋白组分融合在一起而形成的蛋白：一种组分是一种可经强力霉素（doxycycline）诱导而失活的Cas9蛋白版本（dCas9），另一种组分是蛋白KRAB的抑制结构域。为此，研究人员将编码dCas9的基因和编码KRAB抑制结构域的基因融合在一起，形成被称作融合基因dCas9-KRAB的抑制基因，并将该融合基因导入AAV病毒载体中，然后就利用该病毒载体转导宿主细胞（如iPSCs和源自iPSCs的心肌细胞），从而在宿主细胞中表达这种融合蛋白。所产生的融合蛋白停留在基因组靶位点上，抑制基因表达而无需切割DNA。令研究人员吃惊的是，以这种方式暂时地沉默基因表达要比永久性地切割基因组具有更好的准确性和更高的效率。

论文通信作者Bruce Conklin博士说，“我们对这两种系统在性能上存在的显著差异感到吃惊。我们原以为永久性地切割基因组可能能够更加高效地沉默基因，但是事实上，CRISPRi是如此准确地和如此紧密地结合到基因组上以至于它确实是一种更好的基因沉默方法。”

在这项研究中，研究人员比较了CRISPRi和CRISPR-Cas9如何沉默一种控制iPSCs多能性---iPSCs分化为多种类型细胞的能力---的特定基因。他们发现CRISPRi要比CRISPR-Cas9更加高效：CRISPRi能够让95%以上的细胞中的靶基因沉默，而相比之下，CRISPR-Cas9只能让60%～70%的细胞中的靶基因沉默。而且，除了靶基因外，CRISPRi不会导致其他基因的表达发生变化，如不会导致细胞基因组产生不想要的序列插入或删除，而这正是CRISPR-Cas9技术的令人担忧之处。

CRISPRi也好比是一种拨动开关，能够让研究人员通过简单地移除让抑制基因dCas9-KRAB处于开启状态的强力霉素而逆转基因抑制。此外，他们能够通过改变他们加入的强力霉素数量来调整他们在多大程度上沉默一种基因。这些结果都有助于人们对某些基因在影响发育和疾病中发挥的作用进行更加多样化的研究。

研究人员在iPSCs、T细胞以及由iPSCs分化而成的心肌细胞中证实了CRISPRi的强大能力。比如，他们利用CRISPRi的基因组编辑能力抑制对心脏功能必不可少的基因而构建出心脏病模型。

论文第一作者Mohammad Mandegar博士说，“CRISPRi在制造疾病相关的细胞类型中具有重大的优势。利用这种技术，我们能够在利用iPSCs制造出的纯的心脏细胞群体中模拟疾病。这种疾病建模允许我们更加轻松地研究遗传病和潜在地鉴定出新的治疗靶标。”