SNP实验标准操作规程

一、原理

SNP （Single Nucleotide Polymorphism）即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性（Polymorphism）。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性（RFLP）分析还是微卫星标记（STR），都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型（haplotype）。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs（tagSNP）来进行基因分型，获取大部分的遗传多态模式。

二、样品准备

1. DNA抽提

①    1、取新鲜肌肉组织约100mg，PBS漂洗干净，置于1.5ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。

②    加200μl 缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。加入20μl 蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混匀

③    加220μl 缓冲液GB，充分混匀，37℃消化，溶液变清亮。加220μl 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

④    将上述一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB 中，（吸附柱放入废液收集管中）12000rpm 离心30 秒，弃掉废液。

⑤    加入500μl 去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30 秒，弃掉废液。

⑥    加入700μl 漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30 秒，弃掉废液。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 离心30 秒，弃掉废液。将吸附柱CB 放回废液收集管中，12000rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液。

⑦    将吸附柱CB 转入一个干净的离心管中，加入100μl 洗脱缓冲液（洗脱缓冲液应在60-70℃水浴预热），混匀，室温放置15 分钟，12000rpm 离心30 秒。洗脱第二次，将洗脱缓冲液50μl 加入吸附柱中，室温放置15 分钟，12000rpm 离心30 秒。

⑧    采用Beckman DU? 640 spectrophotometer 检测提取到的基因组DNA 浓度，在OD260 处有显著吸收峰。同时检测纯度，OD260/280 的值应为为1.7-1.9。

⑨    从原液中取出相应体积DNA 溶液，稀释致50ng/ul，原液置于-70℃保存，稀释液置于-20℃保存。

2. PCR扩增目的片段

按相关的试剂说明在标准反应管中准备反应体系，典型的PCR反应体系如下（20ul体系）：

10×Buffer     2ul    

Taq酶     1ul     

dNTP     0.5ul    

上游引物     0.5ul    

下游引物     0.5ul     

无菌水     14.5ul    

DNA模板     1ul    

向左扳动仪器盖子上的手柄，揭开仪器盖子，小心放置样品管于仪器的相应样品孔中，轻轻盖上盖子，将顶部的旋钮慢慢旋紧，让热盖紧密接触样品管，样品放置完毕。

3. 在T1型PCR仪上编辑一个程序

按[C programs]进入编辑模式。要在主目录中创建一个程序请按[D enter]。要进入一个子目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键选择一个子目录。按[D enter]进入选择的子目录。

输入程序中要求的温度：用[D enter]确认温度。为其输入时间，用小数点来间隔。顺序为h.m.s。用[D enter]确认时间设置，或者用光标键移动到下一个区域。＃表示循环的次数。设定循环值=总循环值-1，即，总循环数为30时应输入“29”。用[C pgm ok]来储存一个完整的程序。程序数据永久的储存在记忆中。

4. 运行程序

按[B start/stop]选择一个程序。用→↑↓键选择一个子目录，或者用[D enter]进入主目录。输入您想要启动的程序的号码。或者，按[A list]在该子目录中的所有程序的列表中选择一个程序。用↑↓键在列表中滚动选择。用[D enter]确认用强光突出的程序。按[D start]启动程序。

5. 控制测试过程

运行过程中，按A按钮，可以获得程序剩余的时间信息。运行完成后，按STOP按钮终止实验，按YES确认终止。小心旋开热盖，按照放置样品的操作顺序，打开盖子，取出实验样品，再盖上盖子，关闭电源，本次实验结束。

6. PCR产物测序

由专门负责测序的服务公司完成

7. 数据分析

少量可人工读取，大量可软件读取。比对发现的SNP在基因组中的位置：重点是启动子区、外显子区域（包括编码区的cSNP及5’及3’UTR）、剪切边界等，密码子的改变是否导致氨基酸的改变：错义突变、无义突变、终止突变。

8. 注意事项

①  为保证待测目的区域测序真实可靠，引物设计应该使待测目的区域边界距离上下游引物至少各50bp；

② 引物设计建议使用在线方式，以保证成功率；

③ 为保证测序敏感性，PCR产物片段大小应在250bp－650bp范围；

④ 为方便实验，建议引物合成时分装成1 o.d/管，方便将PCR与测序的引物分开；

⑤ 为保证引物的特异性，建议引物设计后在NCBI上blast确认；

⑥ 为防止降解，PCR产物应尽快测序，否则应该保存在-20℃，且时间不宜过长；

⑦ 为保证结果真实性，建议对关键点进行反向测序确认。

人黄体生成素释放激素(LHRH)ELISA试剂盒 Human Luteinizing Hormone-Releasing Hormone,LHRH ELISA试剂盒
人8异前列腺素(8-iso-PG)ELISA试剂盒 Human 8-iso prostaglandin,8-iso-PG ELISA试剂盒
人肾素(Renin)ELISA试剂盒  Human Renin ELISA试剂盒
人肾上腺素(EPI)ELISA试剂盒 Human Epinephrine/Adrenaline,EPI ELISA试剂盒
人雌二醇受体(ER)ELISA试剂盒 Human Estradiol receptor,ER ELISA试剂盒
人甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)ELISA试剂盒 Human Parathyroid Hormone Related Protein,PTHrP ELISA试剂盒
人血管紧张素原(aGT)ELISA试剂盒 Human angiotensinogen,aGT ELISA试剂盒
人血管紧张素Ⅰ(Ang-Ⅰ)ELISA试剂盒 Human angiotension Ⅰ,Ang-Ⅰ ELISA试剂盒
人卵泡抑素(FS)ELISA试剂盒 Human Follistatin,FS ELISA试剂盒
人甲状腺素抗体(TAb)ELISA试剂盒 Human Parathyroid Hormone Related Protein,PTHrP ELISA试剂盒
人儿茶酚胺(CA)ELISA试剂盒 Human catecholamine,CA ELISA试剂盒
人半胱氨酸蛋白酶抑制剂/胱抑素C(Cys-C)ELISA试剂盒 Human Cystatin C,Cys-C ELISA试剂盒
人乙酰胆碱受体抗体(AChRab)ELISA试剂盒 Human acetylcholine receptor antibody,AChRab ELISA试剂盒
人5羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒 Human 5-Hydroxytryptamine,5HT ELISA试剂盒
人抑制素A(INH-A)ELISA试剂盒 Human Inhibin,INH-A ELISA试剂盒
人性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒 Human sex hormone-binding globulin,SHBG ELISA试剂盒
人脱氢表雄酮S7(DHEA-S7)ELISA试剂盒 Human Dehydroepiandrosterone S7,DHEA-S7 ELISA试剂盒
人脱氢表雄酮(DHEA)ELISA试剂盒 Human Dehydroepiandrosterone,DHEA ELISA试剂盒
人降钙素基因相关肽(CGRP)ELISA试剂盒 Human calcitonin gene related peptide,CGRP ELISA试剂盒
人生长抑素(SS)ELISA试剂盒 Human Somatostatin,SS ELISA试剂盒
人生长激素释放多肽(GHRP) ELISA试剂盒 Human Growth Hormone Releasing Peptide,GHRP ELISA试剂盒
人抑制素B(INH-B)ELISA试剂盒 Human inhibin B,INH-B ELISA试剂盒
人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒 Human growth hormone releasing hormone,GHRH ELISA试剂盒
人雌激素(E)ELISA试剂盒 Human estrogen,E ELISA试剂盒
人褪黑素(MT)ELISA试剂盒 Human Melatonin,MT ELISA试剂盒
人6酮前列腺素(6-K-PG)ELISA试剂盒 Human 6-keto-prostaglandin,6-K-PG ELISA试剂盒
人血栓素B2(TXB2)ELISA试剂盒 Human Thromboxane B2,TX-B2 ELISA试剂盒
人皮质酮/肾上腺酮(CORT)ELISA试剂盒 Human Corticosterone,CORT ELISA试剂盒
人前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒 Human Prostaglandin E2,PG-E2 ELISA试剂盒
人双氢睾酮(DHT)ELISA试剂盒 Human Dihydrotestosterone,DHT ELISA试剂盒
人促生长激素释放激素(GHRH)ELISA试剂盒 Human growth hormone releasing hormone,GHRH ELISA试剂盒
人雌激素(E)ELISA试剂盒 Human estrogen,E ELISA试剂盒
人孕激素/孕酮(PROG)ELISA试剂盒 Human Progesterone,PROG ELISA试剂盒
人超敏游离雌三醇(uE3)ELISA试剂盒 Human ultra Estriol,uE3 ELISA试剂盒
人去甲肾上腺素(NA) ELISA试剂盒 human Noradrenaline,NA ELISA试剂盒
人前列腺素F(PGF)ELISA试剂盒 human Prostaglandin F,PG-F ELISA试剂盒
人前列腺素E1(PGE1)ELISA试剂盒 human Prostaglandin E1,PG-E1 ELISA试剂盒
人内皮素1(ET-1)ELISA试剂盒 human Endothelin 1,ET-1 ELISA试剂盒
人促卵泡素(FSH)ELISA试剂盒 Human follicle-stimulating hormone,FSH ELISA试剂盒
人游离β绒毛膜促性腺激素(f-βhCG)ELISA试剂盒 human free chorionic gonadotropin,f-βhCG ELISA试剂盒
人大内皮素(Big ET)ELISA试剂盒 Human Big Endothelin,Big ET ELISA试剂盒
人全段甲状旁腺素(i-PTH)ELISA试剂盒 Human intact Parathormone ,i-PTH ELISA试剂盒
人降钙素(CT)ELISA试剂盒 Human Calcitonin,CT ELISA试剂盒
人促甲状腺素(TSH)ELISA试剂盒 Human Thyroid Stimulating Hormone,TSH ELISA试剂盒
人皮质醇(Cortisol)ELISA试剂盒 Human Cortisol ELISA试剂盒
人雌二醇(E2)ELISA试剂盒 Human Estradiol,E2 ELISA试剂盒
人脱氢表雄酮硫酸酯(DHEA-S)ELISA试剂盒 Human Dehydroepiandrosterone sulfate,DHEA-S ELISA试剂盒
人睾酮(T)ELISA试剂盒 Human Testoterone,T ELISA试剂盒
人游离睾酮(F-TESTO)ELISA试剂盒 Human Free Testoterone,F-TESTO ELISA试剂盒
人雄烯二酮(ASD)ELISA试剂盒 Human Androstenedione,ASD ELISA试剂盒
人雌三醇(E3)ELISA试剂盒 Human Estriol,E3 ELISA试剂盒
人17羟孕酮(17-OHP)ELISA试剂盒 Human 17-Hydroxyprogesterone,17-OHP ELISA试剂盒
人三碘甲状腺原氨酸(T3)ELISA试剂盒 Human Tri-iodothyronine,T3 ELISA试剂盒
人甲状腺素(T4)ELISA试剂盒 Human thyroxine,T4 ELISA试剂盒
人甲状腺素(T4)ELISA试剂盒 Human thyroxine,T4 ELISA试剂盒
人游离甲状腺素(FT4)ELISA试剂盒 Human Free Thyroxine,FT4 ELISA试剂盒
人游离三碘甲状腺原氨酸(Free-T3)ELISA试剂盒 Human Free Tri-iodothyronine Indes,Free-T3 ELISA试剂盒
人新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒 Human Neonatal Thyroxine,NN-T4 ELISA试剂盒
人胰岛素(INS)ELISA试剂盒 Human Insulin,INS ELISA试剂盒
人C肽(C-Peptide)ELISA试剂盒 Human C-Peptide ELISA试剂盒
人绒毛膜促性腺激素(HCG)ELISA试剂盒 Human Chorionic Gonadotrophin,HCG ELISA试剂盒
人绒毛膜促性腺激素β(β-CG)ELISA试剂盒 Human Chorionic Gonadotrophin β,β-CG ELISA试剂盒
人促黄体激素(LH)ELISA试剂盒 Human luteotropic hormone,LH ELISA试剂盒
人泼尼松龙(PS)ELISA试剂盒  Human Prednisolone,PS ELISA试剂盒
人瘦素(LEP)ELISA试剂盒 Human Leptin,LEP ELISA试剂盒
人苗条素受体(LR/Ob-R)ELISA试剂盒 Human Leptin receptor,LR/Ob-R ELISA试剂盒
人生长激素(HGH)ELISA试剂盒 Human growth hormone,HGH ELISA试剂盒
人红细胞生成素(EPO)ELISA试剂盒  Human Erythropoietin,EPO ELISA试剂盒
人红细胞生成素受体(EPOR)ELISA试剂盒 Human Erythropoietin receptor,EPOR ELISA试剂盒
人β-微管蛋白(TUBB)ELISA试剂盒 human β-tubulin,TUBB ELISA试剂盒
人前列腺素F2α(PGF2α)ELISA试剂盒  Human Prostaglandin F2α,PGF2α ELISA试剂盒
人总前列腺特异抗原(tPSA)ELISA试剂盒  Human total prostate s pecific antigen,tPSA ELISA试剂盒
人抗人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)ELISA试剂盒  Human anti-immunodeficiency virus antibody,HIV ELISA试剂盒
人解脲脲原体抗体(UU-Ab)ELISA试剂盒  Human Ureaplasma urealyticum antibody,UU-Ab ELISA试剂盒
人复合前列腺特异性抗原(CPSA)ELISA试剂盒  Human complex edprostate specific antigen,cPSA ELISA试剂盒
人单纯疱疹病毒Ⅱ型抗体(HSVⅡ-Ab)ELISA试剂盒 Human Herpes simplexvirus Ⅱ antibody,HSVⅡ-Ab ELISA试剂盒
人雌激素诱导蛋白PS2 ELISA试剂盒 Human Estrogen-induced protein pS2 ELISA试剂盒
人细菌性阴道病(BV)ELISA试剂盒  Human bacterial vaginosis,BV ELISA试剂盒
人单纯疱疹病毒Ⅰ型抗体(HSVⅠAb)ELISA试剂盒 Human Herpes simplexvirusⅠantibody,HSVⅠAb ELISA试剂盒
人雌激素诱导蛋白PS2 ELISA试剂盒 Human Estrogen-induced protein pS2 ELISA试剂盒
人乳头状瘤病毒抗体IgM(HPV-IgM)ELISA试剂盒  Human papillomavirus IgM,HPV-IgM ELISA试剂盒
人乳头状瘤病毒抗体IgG(HPV-IgG)ELISA试剂盒  human papillomavirus IgG,HPV-IgG ELISA试剂盒
人单纯疱疹病毒抗原2(HSV-Ag2)ELISA试剂盒  Human Herpes simplex virus 2,HSV-Ag2 ELISA试剂盒
人游离前列腺特异性抗原(fPSA)ELISA试剂盒 Human Free Prostate Specific Antigen,fPSA ELISA试剂盒
人前列腺特异性抗原(PSA)ELISA试剂盒 Human prostate specific antigen,PSA ELISA试剂盒