考马斯蓝染色法又称Bradford法,是Bradford于1976年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色,zui大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有zui大光吸收。
实验仪器 分析天平、烧杯、玻璃杯、移液枪、紫外分光光度计或酶标仪。 实验试剂 ①标准蛋白溶液:常用牛血清蛋白(BSA),配制1mg/mL的标准溶液。 ②0.01%考马斯亮蓝染色液G-250:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于95%乙醇中,加85%(m/V)的磷酸10mL,zui后用超纯水定容至100mL,装入棕色瓶中保存。(不宜久存,室温1-2个月) 实验步骤 紫外分光光度计测定
将表格所示溶液加入试管中充分混匀,10min后倒入比色皿,放入紫外分光光度计于595nm测定吸光值,1号管作为空白对照,以蛋白浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标曲作为定量依据。
②样品测定
取含10-100μL蛋白质溶液于小试管中,加水稀释至0.1mL,然后加入5mL G-250蛋白染色液,充分混匀,10min后倒入比色皿,放入紫外分光光度计于595nm测定吸光值,1号管作为空白对照,将测得吸光值带入标准曲线计算样品中的蛋白质含量。
酶标仪测定
将表格所示溶液依次加入酶标板中混匀,静置10min后,放入酶标仪中于595nm测定吸光值,A孔作为空白对照,以蛋白浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标曲作为定量依据。
②样品测定
取含4-40μL蛋白质溶液于酶标板中,加水稀释至40μL,然后加入250μL G-250蛋白染色液,充分混匀,静置10min后,放入酶标仪于595nm测定吸光值,A孔作为空白对照,将测得吸光值带入标准曲线计算样品中的蛋白质含量。
注意事项 ①通常会将样品稀释多个梯度进行测定,防止样品测得吸光值过高,超出标曲导致的含量计算偏差。 ②样品中若含有去污剂,如TritonX-100、SDS等,会严重干扰测定结果。 ③比色反应需在1h内完成,如果测定要求很严格,可以在染色液加入后的5-20min内测定吸光值,因为在这段时间内颜色是zui稳定的。 ④测定时,蛋白-染料复合物会有少部分吸附在比色皿杯壁上,测试完后可用乙醇溶液将比色皿中的残留物冲洗掉,再用超纯水冲洗干净保存。
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