各位小伙伴在做方法开发时,缓冲盐是经常会使用到的一类试剂,那么小伙伴们对缓冲盐了解多少呢,我们该如何选择合适的缓冲盐呢,这里就让小编给各位小伙伴们讲解一二。
什么时候需要缓冲盐?
在反相色谱分析中,流动相的pH值一般在2-7之间,当分析物在反相条件下可解离,或样品的pH值在2-7之外时,就需要缓冲盐,在反相条件下可解离的化合物一般有氨基和羧基,他们的pKa在1-11之间,选择正确的缓冲液pH值可保证解离的官能团处于一种形式,离子形式或中性化合物的形式;如果样品的pH值对柱子有伤害,则缓冲溶液可使其变温和或减小其危害,常规硅胶基质色谱柱的pH耐受范围2-8。
常见缓冲盐分类
碱类
碱类添加剂常见的是氨水和三乙胺,两者都能让水的pH到达非常高的水平,高到能把硅胶颗粒溶解掉,要慎用,另外就是这两种溶剂通常不太容易通过冲洗维护的方式清除掉。尤其是三乙胺,即使是色谱纯,放的久了也可能会由于变质导致污染。
酸类
甲酸:通常使用的浓度在1%以下,能够让水的pH达到二点几的级别。
乙酸:酸性比甲酸略弱,通常使用浓度不超过5%,能够使水的pH到达到二点几的级别。
三fu乙酸:比较强的酸,使用浓度通常不超过0.5%,能使水的pH达到2以下,具有很大的离子强度及一定的离子对作用,是分析蛋白/多肽时常用的添加剂。以上三种酸z致命的问题在于低波长下的紫外吸收,通常不建议在小于215nm波长的情况下使用,另外就是甲酸/乙酸还有比较大的挥发性,时间久了浓度会发生变化。
磷酸:这是一种不具有挥发性的酸,离子强度也不错,重要的是,它在低波长紫外区无本底吸收,但是它也存在不少缺点,比如不能兼容质谱方法。
除此之外,还有一些其他的酸,比如硫酸,盐酸或者柠檬酸,但是都是非常罕见。
盐类
相比单纯的酸碱,根据不同缓冲盐中两种盐的配比,可以很容易的配置出一定pH的缓冲溶液,具有缓冲能力的盐类可以很好的控制流动相的pH值。
甲酸盐:通常在液相色谱中常用的甲酸盐都是甲酸铵,这类盐的溶解度好,完全兼容液质联用的方法,对色谱柱的伤害也比较小,但是缺点是离子强度比较低。另外就是甲酸盐比较容易潮解,称量的时候比较困难,在流动相里还可能挥发。
与甲酸配合,可以得到甲酸-甲酸铵缓冲体系,大概缓冲能力在pH3~4.5的范围之内,只要调节两者浓度的比例即可。
乙酸盐:常见为乙酸铵。在使用上,和甲酸盐十分类似,离子强度也不高,与乙酸配合的乙酸-乙酸铵缓冲体系pH的控制能力在pH4~5.5左右。
磷酸盐:是HPLC在紫外检测条件下常用的缓冲液之一,因为它可以在低于220 nm的波长下使用。磷酸盐具有三个pKa值,可提供pH 1.1-3.1,6.2-8.2,11.3-13.3三个缓冲范围。虽然它使用广泛,但是也要注意它的溶解度问题,防止高浓度条件下在HPLC泵或者色谱柱中析出。
常用的是磷酸的钠盐和钾盐,二者对pH的控制能力十分接近,只是离子强度稍有差异,绝大多数情况下是可以互换使用的,磷酸由于是多元酸,能够形成一氢盐和二氢盐,所以使用磷酸缓冲体系调节pH也是组合比较多,跨度比较大的,并且可以提供较高的离子强度,可惜,磷酸盐流动相体系无法兼容质谱。
以磷酸钠盐为例,可以有以下两种组合的缓冲体系:
磷酸-磷酸二氢钠:pH可以达到1.2~3.1左右的范围。
磷酸二氢钠-磷酸氢二钠:pH可以达到6.5~8左右的范围。
通过样品的pka值选择合适缓冲盐
pH 变化会对不同结构化合物的色谱行为产生不同的影响。中性化合物在反相色谱系统的保留与pH 无关;
酸性化合物在pH 趋于酸性(pH 变小,尤其低于化合物的pka 值)时会因状态趋于中性而增加保留;
碱性化合物在pH 趋于碱性(pH 变大,尤其高于化合物的pka 值)时会因状态趋于中性而增加保留。
反之,高pH 时酸性化合物保留降低;低pH时碱性物质保留会降低。若想获得稳定的保留,对于酸性待测物而言,流动相的pH 值-好低于待测物pka值两个单位;对于碱性待测物来说,流动相的pH值--好高于待测物pka值两个单位。
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