小伙伴们大家好,在前期已经介绍了色谱柱老化过程中,我们需要注意哪些细节?那么,今天我们就详细地聊一聊温度对气相分析的影响,在气相的恒温分析和程序升温中,该如何来选择并进行方法优化?
不管是程序升温还是恒温分析,最终目的都是将样品中的多种化合物达到基线分离,并呈现峰形尖锐,符合高斯分布的色谱峰。分离度在色谱分析中是衡量柱效至关重要的参数,那么影响分离度的因素有哪些呢?首先,我们先了解一下分离度方程。
01 分离度方程
上述公式中Rs代表分离度,N代表色谱柱柱效,α代表选择性,K是指保留因子。
保留因子K:对化合物来说,温度对保留时间的影响主要表现为:柱温越高,保留越弱,保留时间越短;柱温降低,保留增强,保留时间延长。一般而言,柱温每上升30℃,保留时间就会降低50%。
选择性α:柱温降低有利于改善分离度。
柱效N:柱温对色谱柱柱效也有一定的影响,一般情况下,柱温升高,保留时间缩短,峰宽变小,柱效升高。
02 气相分析方法中的恒温分析和程序升温分析
在恒温分析中,气相色谱柱的柱温是不变的,主要适合分析沸点差异不大、保留性质相近的化合物。
但是,当待测组分之间保留性质相差较大时,晚出峰的化合物色谱峰会出现峰宽较宽、峰形变差、灵敏度不高等各种问题;较早流出的化合物色谱峰又会呈现分离度不好的现象。针对此种情况就需要使用程序升温方法。
在程序升温方法中,色谱柱起始温度较低,有利于改善较早流出色谱峰的分离度。然后随着柱温上升,并在方法z高温度下保持一段时间,可以让较晚出峰化合物的保留时间前移,提高工作效率。
03 升温程序的优化
一般情况下,可以采用下面的升温梯度,来作为方法优化的起始。
■ 起始温度不要太高,建议设置为比实验室室温高15℃即可
■ 升温速率建议设置为10℃/min
■ z高温度设置为色谱柱恒温温度上限以下20℃左右,然后保持10min,观察色谱图中待测组分的分离状态
■ 再根据得到的色谱图对升温条件进行进一步优化
1、升温方法的选择
在色谱图中,如果待测组分(所有化合物)出峰时间的“窗口”小于整个程序升温时间的1/4,那么就建议采用恒温分析。此时,恒温温度建议设置为比最后一个峰的出峰温度低45℃,然后再以10℃左右上下调整,直到达到所需的分离度。
另外,若是所有化合物出峰时间的“窗口”大于整个程序升温时间的1/4,或者采用恒温分析方法无法达到满意的分离度,此种情况就需要使用程序升温的分析方法。
2、程序升温中,起始温度的设定
■ 若是不分流进样,一般将初始温度设置为低于溶剂沸点10-20℃,并维持1min。目的就是降低溶剂效应,因为不分流进样时,样品膨化体积较大,载气流速相对来说较小,气化后的样品不能瞬间进入色谱柱。将初始温度设置为低于溶剂沸点10-20℃,并维持1min,有利于溶剂冷凝聚焦,获得更窄的峰展宽,提高分离度。
■ 若是分流进样,相对来说衬管里的载气流速很快,待测组分能够很快进入色谱柱。所以不需要对样品进行冷凝聚焦,初始温度的设置没有特殊要求。
此外,有时候还可以通过稍微降低初始温度和延长保持时间,来提高较早流出色谱峰的分离度。
3、升温速率的设定
一般情况下,升温速率越快,整体色谱峰的保留时间缩短,出峰也就越快,可以提高工作效率,但同时也会降低色谱峰的分离度。所以我们是希望用最短的分析时间,来获得z佳的分离效果。推荐的升温速率可以用以上公式来计算:T0为死时间,指的是从进样开始,不被固定相保留的组分出现峰最大值时的时间。
4、恒温平台的设定
当我们采用同一个升温速率,有些化合物的色谱峰还是达不到满意的分离度,可以在这部分化合物出峰温度以下45℃左右设置一个恒温平台,在此温度下维持2-5min,然后继续升温。若是待测组分种类比较多,为了达到较好的分离度,可能需要设置多个恒温平台。
5、结束温度的设定
关于结束温度,一般设置为比最后一个色谱峰出峰温度高20℃左右。若是样品基质比较复杂或者不分流进样,需要把结束温度设定的稍高一些,目的是对气相柱进行高温烘烤,除去可能存在的高沸点杂质。但同时需要注意设定的温度不能超过色谱柱使用温度上限。
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