很多时候,实验室的小伙伴们都是参照标准来进行实验,可标准上一句“以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂”就足够让小伙伴们选择困难症犯,更不用说是自己做方法开发的实验了。的确,色谱是一门实验学科,没有谁能在未做实验的情况下预测出哪一根色谱柱能完成分离任务,尤其是当标准没有明确推荐色谱柱品牌型号的时候,这也就导致很多小伙伴经常内心OS:C18柱那么多,哪个才能分的最好?
别急,虽然我们不能准确地预测实验结果,但把握基本的色谱柱性能参数还是可以做到的。下面就听小编细细道来。
01 载碳量
众所周知,反相C18在当今色谱分离领域依旧承担着ji大比例的分离任务,就是因为其性质适合大多数化合物的色谱分离,那么在选择色谱柱的时候,就一定要注意色谱柱本身的适用性,尽可能选择普适性强,适用面广的色谱柱,而C18柱的“载碳量”这一参数,就是尤为重要的参数之一。
对于一根普适性强的C18色谱柱,载碳量参数是在10%~20%之间,尤以20%附近z佳(16%-22%),因为这样比例略高的载碳量,在保证了化合物能有效保留的前提下,活性位点数量减小,出现残留吸附的情况也会减小。另外,稍高于普通C18的键合密度也有助于色谱键合相选择性的提高。
02 硅胶纯度
除了特殊情况以外,越是适用性强的填料越要选择B型硅胶。B型硅胶的硅胶纯度>99.999%,金属离子含量<10 ppm,并且孔径和粒径分布更加均匀,这样得到的色谱峰展宽更小,峰形更加对称。
03 封尾
不同品牌色谱柱的封尾工艺和封尾试剂不一样,这也是导致都是C18,性质差异却较大的原因之一。除非标准特殊说明使用未封尾色谱柱,一般情况下,优先选择使用封尾的色谱柱(End-Capped),尤其是双封尾色谱柱,进行实验。
04 比表面积
可能很多小伙伴都会有意无意地忽略掉色谱柱的比表面积这个参数,其实这也是影响色谱柱性能的一个很重要的参数。比表面积的大小,将影响到键合相覆盖率的高低,以及目标物与键合相发成相互作用的概率大小。比表面积的大小,还会影响梯度平衡时间的长短。那么,在选择普适性强的色谱柱的时候,尽可能选择比表面积在180m2/g~450m2/g的色谱柱,像常见的320m2/g,350m2/g,420m2/g,450m2/g,都是适用面比较广的。
05 孔径
孔径的选择取决于分子量的大小。一般来说,要求孔径是分子直径三倍以上,这样分子才能顺利进入孔中有所保留。以分子量2000为界,分子量<2000,可以选择100?、120?、150?等孔径;分子量>2000,如多肽,核酸等大分子的分离,可以选择300?,甚至孔径更大的色谱填料。
06 色谱柱规格
如果标准上有指定具体的色谱柱规格,那无需多言。但当我们自己在做方法开发的时候,无从得知什么规格最合适,而柱长、内径、粒径的不同又会影响到柱效、分离度、保留时间等系统适用性值,选择的不合适还可能造成色谱柱压力过高或污染。因此,保险起见,小伙伴们一开始可以选择4.6×250mm,5μm的色谱填料,这样5μm粒径柱压不会很高,也便于冲洗维护;柱长够长,多组分样品也具有一定的分离效率;柱内径也不至于太小而造成超载。
07特殊基团
特殊基团一般是指为了使得色谱填料具有独特的特性和不一样的选择性,从而在色谱柱的键合工艺或封尾工艺过程中,添加的特殊官能团试剂。这些试剂的加入固然有助于分离一些本不易分离的组分,但是,在进行常规实验,或方法建立初期,不建议选择添加特殊基团的色谱柱,否则色谱分离的重现性可能在后续的实验中成为潜在的问题。
怎么样,通过上述的介绍,小伙伴是不是现在对色谱柱的参数有了更全面的认识了呢,以后在选择色谱柱的时候也会更有方向感,不会再如“雾里看花”一般不知如何选择了吧。
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