各位小伙伴在做实验过程中通常会遇到各种奇奇怪怪的问题,其中色谱峰出现双峰可以说是经常会遇见的一类问题。遇见双峰了该怎么去解决呢,这里听小编慢慢道来。
HPLC分析中,在色谱柱正常,样品灵敏度足够,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度),峰型应对称而尖锐。但是,在对样品了解程度不够,方法不妥,样品处理方法及进样方式不合理下,会出现各种意想不到的问题,而对色谱峰难以作出合理的解释,尤其对于新手更是如此。色谱双峰指的是一种物质,但在色谱图中出现双峰,这种情况分为四种原因。
1.色谱柱堵塞或污染
如果你分析样品时发现每个色谱峰都出现双峰(出峰越快,出现双峰的可能性越少),尤其采用单一纯物质时,可以判定色谱柱出问题(柱头受损或柱头固定相变脏或流失)。如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头端堵塞,将色谱柱反接冲洗维护,一般情况下可以解决。如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头填料受污染或键合相流失可能性更大,这时可以对色谱柱维修处理或者使用新的色谱柱,维修建议交由厂家处理。
2.溶剂极性及进样量不合适
许多小伙伴对此可能不以为然,一般的书籍和文献都不会提到这方面的内容,而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,以及各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解,溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的。当用极性强度大的试剂做溶剂时,如纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主,样品进样量大,如20ul,单一的纯物质出双峰,第二峰比第yi峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。
另一个原因是,进样量不一定大,但浓度很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。
3.样品的特性和PH值不了解
有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时,在一个特定的条件下,一种物质将出现双峰,甚至三峰。这时一般双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其改变pH,双峰现象将消失。
pH对峰形的影响在缓冲液流动相平衡过程中非常明显,当连续进样时,受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外,在样品分析时,流动相的pH尽量远离被分析物的等电点,否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时,选择不好条件也会容易引起双峰的产生。
4.仪器参数设置不合理
参比波长设置错误,例如设置分析波长254nm,参比波长400nm,这个对于大多数化合物可能没影响。但是如果被测化合物,在400nm处也有强的紫外吸收,比254nm更高。这样其出峰时,由于背景的抵扣作用,本来一个峰会变成对称的二个峰,而且如果将二峰之间的峰谷反转180度,恰好是一个完整的峰。这时要将参比波长设置更大,或者取消。
以上就是小编给各位小伙伴整理的出现双峰的原因和对应解决方案,高效液相色谱是一套非常精密的分析系统,一旦出现异常峰形需要认真排查原因,找到合适解决方案。各位小伙伴若还有任何疑问,欢迎咨询我们的当地销售或经销商。
更多
秉承奥运精神,强健体魄!月旭销售部24年首期健身活动圆满成功
厂商
2024.08.14
高温、雷电、暴雨!液相色谱仪新增注意事项速看
厂商
2024.08.12
【直播预告】溶出仪机械验证法规规定和实际应用
厂商
2024.07.26
【7月】月旭电商,签到有礼
厂商
2024.07.24