简 介
1975年,Porath等人提出了一种新的纯化方法-固定化金属鳌合层析,利用金属离子(Ni2+,Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用,来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。
组氨酸标签由于分子量小,几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构而被广泛的使用。固定的金属离子亲和层析是纯化组氨酸标签蛋白的最常用方法。
组氨酸标签蛋白的纯化工具
月旭Ni亲和填料Ni Tanrose 6FF(NTA)
Ni Tanrose 6FF(NTA)亲和介质是将金属离子Ni2+鳌合在以氨三乙酸为配基的6%高度交联的琼脂糖凝胶上形成的亲和层析介质。月旭科技研发的Ni Tanrose 6FF(NTA)不仅纯化纯度较高,通过控制合理的Ni离子密度,结合载量可达到~40mgHis标签蛋白/ml介质,可以用于各种表达来源(如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的组氨酸标签(6xHis-tagged)蛋白的纯化。NTA含有四个螯合区,较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6xHis可与Ni2+螯合,从而使His标签蛋白结合在Ni Tanrose 6FF(NTA)纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液被温和的洗脱下来,从而得到高纯度的目标蛋白。具有载量高、选择性好、易于再生、成本低等优点。有了它,再也不用担心完不成纯化任务了。
PreCot Ni 6FF(NTA)是Ni Tanrose 6FF(NTA)的1ml和5ml预装柱,用来纯化6xHis-tagged蛋白,可以使用注射器、蠕动泵,或者液相层析系统(例如AKTA或FPLC)。
Ni Tanrose 6FF(NTA)应用案例
预装柱:PreCot Ni 6FF(NTA) 5ml
样品:含有His标签蛋白(大肠杆菌表达)
平衡液A:50mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20mM咪唑pH8.0
洗脱液B:50mM Tris-HCl,0.5M NaCl,0.5M 咪唑,pH8.0
流速:平衡、洗脱-1.0ml/min上样-0.5ml/min
PreCot Ni 6FF(NTA)纯化His标签蛋白的纯化色谱图
1:原液
2:流穿
3:洗脱(100%B)
4:原液
5:流穿
6:洗脱(100%B)
备注:1-3(样品和平衡液中不含咪唑);4-6(样品和平衡液中含20mM咪唑)
由于宿主蛋白中也存在组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基,其他的非特异性蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析填料结合,造成纯化样品纯度不高。提高样品中的咪唑浓度,组氨酸标签蛋白通过Ni Tanrose 6FF(NTA),可以一步纯化得到85%以上纯度的纯化样品。
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