高分辨溶解曲线分析系统LightScanner32+RT-PCR

LightScanner 32 (LS32)由美国Idaho公司生产，是同时具有高分辨率溶解曲线和定量PCR双重功能的分析系统，是目前世界上最快速的实时定量PCR仪器。它采用空气热循环技术，可以自动对目的核酸进行分析。 LightScanner 32 每次可以分析 32 个样品，并且所需的时间不超过 60 分钟。

LS32 仪器是三色实时荧光定量检测和高分辨率熔解曲线分析功能的整合。通过采用一系列标记的探针如 SimpleProbes, FRET probes 和 HybProbe ，仪器可以用来进行实时定量 PCR ，当采用 LCGreen Plus 染料时，仪器可以产生理想的高分辨率的熔解曲线用来分析。

该系统包括计算机控制，并且在电脑上已经预先安装好了便于操作和分析的软件。该软件可以自动的收集和解释数据，并且将分析好的结果以报告的形式产生。

温度控制

LS32 的温度控制由处在循环室内的温度传感器来控制调节。周围环境的空气由进气风扇吸入，产生正压力后，使得空气通过加热管道进入反应室内。空气在加热管道的末端由加热卷进行加热，然后由第二个风扇将空气分散在小室内。冷却过程以同样的方式进行——将未被加热的空气抽入到小室中来冷却样品。

这种方法是目前为止世界上最迅速的改变 PCR 反应温度的方法，使得 PCR 反应可以在 15 至 20 分钟之内完成。

荧光计的组成

一个三通道的荧光计模块用于实时检测每个扩增反应过程中的染料或者探针。荧光计中的三个通道可以同时读取并记录每个样品中所获得的荧光。每个样品的激发是由一个 LED 发射的光通过调谐后的滤光器，由二向色镜产生的 470 nm 处的波长激发的。三种检测通道也都是经过滤光器的，产生波长分别为 530 nm, 640 nm, 和 710 nm 的光波

为了激发荧光，每个仪器都配备有一个 LED 光源。这种 LED 光源不需要维护并且有相当长的寿命。荧光计有三个通道，可以检测波长变化的发射光。 由于高质量的光学性能，使得测量变得非常的迅速和灵敏。在普通的扩增过程中，对于一个样品的测量一般只需要 20 毫秒。

高分辨率熔解曲线分析

LightScanner32荧光定量PCR集成了美国Idaho公司先进的高分辨溶解曲线功能（HRM），在染料 LCGreen Plus 的帮助下，高分辨率熔解曲线分析可以鉴别出 PCR 产物中杂合的单碱基突变。这种方法比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在 400 bp 或者更小时，灵敏性最高。

除了能鉴定出未知的杂合突变，高分辨率熔解曲线还可以被用来鉴定特定位点的突变，在这种情况下，扫描未知突变和进行基因分型可以结合在一起，使得分析更为简单。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力。这种方法能鉴定出大多数的纯合突变，但不能保证可以鉴定出所有的纯合突变。

在 LS32 系统中，高分辨率熔解曲线分析是在完成 PCR 反应之后开始的。温度控制的熔解发生器在样品下方，通过一种被保护的方式上升到毛细管处，然后对 PCR 产物进行热变性。同时也自动收集高密度的荧光数据。

当达到目标变性温度以后，熔解发生器会下降从而和样品分离，同时由高速风扇对其降温。该过程不断的重复直到所有的样品都被熔解。然后加热装置下降，启动冷却过程，随后移动到另一个毛细管处

LS32 有最为卓越的控温能力和数据采集速度。 LS32 极好的灵敏度和特异性几乎可以满足所有扫描未知突变和进行基因分型的工作。