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本产品仅供科研
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产品名称:DUSP3探针法荧光定量PCR试剂盒使用手册V1.0
1.即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物等组分经过优化,灵敏度高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据高度保守区设计,不会跟其他的DNA/RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。
包装规格及成分(具体信息详见说明书):
探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | |
探针法qRT-PCR酶混合液 | 50μL | |
荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL | |
PCR引物-探针干粉 | 50T | |
PCR阳性对照(107拷贝/μL) | 50μL |
DUSP3探针法荧光定量PCR试剂盒使用手册V1.0操作过程:
一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10E6 拷贝/μL 这6 个10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
1. 如果有 N 个样品待提取,最好设置 N+2 个提取,多出的是PC(样品制备阳性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL 再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为 PC。另外用水作为 NC。
2. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
如果进行定量分析,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线样品。如果做定性分析,则6个标准曲线样品只选一个做(可以选4号,其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。
四、数据处理
1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log 值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的 log 值,再推算出其浓度。
2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 39。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于40 则为阴性,如果小于或等于 39 则为阳性。如果在 39-40 之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。
盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
过程 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 50℃ | 10min. |
预变性 PCR反应 (40个循环)
| 95℃ | 10min. |
95℃ | 15sec. | |
60℃ | 60sec(采集FAM通道的荧光信号, |
DUSP3探针法荧光定量PCR试剂盒使用手册V1.0注意事项
1操作严格按照说明书进行;
2试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
3反应液应避光保存;
4反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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