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一键询价末端转移酶(TdT)是一种不依赖于模板的DNA聚合酶,催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子 均可作为TdT的底物,加尾长度可达5~300nt。本酶经电子重构架技术筛选,使其可以在45°C高温下反应,从而避免因DNA二级结构造成的加尾效 率下降。优化的活性中心结构,使其对模板底物结合能力更强,底物加尾比例更高。该末端转移酶(TdT)广泛用于DNA的3’末端添加同聚物、利用修饰碱基(如 ddNTP,DIGdUTP)标记DNA 3’末端、TdT介导的dUTP 缺口末端标记技术(细胞凋亡的原位检测)等试验。
应用
寡核苷酸或DNA 3’羟基末端标记
DNA末端加尾(DNA tailing)
5’-RACE
合成同一种脱氧核苷酸的寡聚链
活性定义
37℃ 60分钟内,催化1nmol dNTP加入到多聚核苷酸3’羟基末端中所需的酶量定义为1个活性单位
储存
-20℃可保存3年。
热失活
75°C 20min。
注意事项
1、适量EDTA可使Terminal Transferase的活性丧失。
2、金属离子螯合剂,较高浓度的铵根离子、氯离子、碘例子和磷酸根离子均对Terminal Transferase活性具有抑制作用。
热失活
75°C,20min。
应用实例1:在以A3824-03或 A3828-03,用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果,可以看到检测反应<20min(达平台期)。
应用实例2: 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略,在反应结束后,倒置反应管,溶解管盖上染料后,阳性样本呈现出醒目的绿色,阴性表现出橙色,区分明显。且该方法不受样本类型限制,杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。
应用实例3:采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2,结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性,而60℃条件下1min内酶活完全释放,恢复100%活性