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其他参数
RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)
商品属性:
货号 | 规格 | 产品名称 |
P-PR1264-1ml | 1ml | RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG) |
P-PR1264-25ml | 25ml | RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG) |
产品介绍:
描述:
RAPA3G Probe qPCR MasterMix 将热启动 RAPA3GDNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP 染料等试剂预混在一起,是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品不含有 ROX 校正染料,适用于各种荧光标记探针,并且适用于各种定量 PCR机型。优化的反应缓冲液,使得该制品可用于单重及多重的探针法定量 PCR。制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶,其具有最高的杂质耐受性,其对乙醇、胍盐、肝素、血清、植物多糖多酚具有极高的耐受性,因此可用于粗样品的直接定量 PCR 检测(Direct PCR)。该酶经化学法修饰,在 50℃以下 100%无活性,只有 95 度条件下加热 5min 后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩增,极大的提高了 PCR 扩增特异性。由于 RAPA3G DNA 聚合酶对 dUTP 具有极强的识别能力,该制品中的 dTTP 核酸碱基完全被 dUTP 所取代,因此扩增产物均包含 dUTP,在配合热敏 UDG(该酶在 95℃热变性 5min 后不可逆失活,不影响后续 PCR 反应)的条件下能达到最佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的测试条件下,Ct 推迟 15 个以上(污染去除能力>99.997%)。
储存:-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃,保存 3 个月。如出现白色沉淀溶解后使用,不影响反应性能。该试剂经 30 次冻融后性能无下降,因此不使用时请置于-20℃避光保存。
RAPA3G DNA 聚合酶对抑制物耐受性
SDS 0.01% Serum 2%
EtOH 5% Plasma Citrate 2%
Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%
Hematin 30μM Trizol 0.5%
操作方法:
1、按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系:
终浓度
2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×
Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
其它引物和探针 X
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法,程序如下:
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
60℃ 30 s 收集信号 退火/延伸
注意事项:
注意:退火延伸温度可在 55-65℃调整
3. 在多数情况下,采用两步法程序可获得理想的扩增效果,在无法达到预期理想效果的情况下,也可采用三步法 PCR程序,程序如下:
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
55℃ 10 s 退火
72℃ 30 s 收集信号 延伸
4. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线和标准曲线。
注意:消化污染步骤中的温度设置可在 25-37℃之间均可,无显著差异,但高于 42℃以上的温度会导致热敏 UDG 消化能力急剧下降。
pcr相关试剂实验结果分析:
PCR实验结果的分析涉及多个方面,包括实验操作、试剂质量、实验条件等,这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。以下是对PCR实验结果分析的一些关键点:
循环次数过多:增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用两种温度的PCR循环,可以有效避免循环次数过多导致的问题。
退火温度过低:退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要,过低的退火温度可能导致非特异性扩增,影响结果的准确性1。
电泳体系问题:包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、凝胶没有凝固好、琼脂糖质量差等问题,这些都会影响DNA片段的分离效果。
试剂盒问题:运输储存不当可能引起试剂盒失效,试剂盒本身质量问题如引物选择、循环参数设置不当也可能导致实验失败1。
降解的陈旧模板:使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布,影响结果的解读1。
PCR假阴性结果:可能由引物长度不够、试剂浓度不标准、靶序列突变或缺失、循环参数设置错误、标本中有Taq酶抑制剂、PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。
为了获得准确的PCR实验结果,需要注意以下几点:
确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。
在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测,以便及时对反应条件进行调整。
防止样本的污染和交叉感染,以免影响PCR反应的准确性和可靠性。
通过上述分析,可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素,从而提高实验结果的准确性和可靠性。
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