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- 产品分类:PCR相关
- 包装:盒装
- 用途:用于科研实验
RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)
商品属性：
货号 | 规格 | 产品名称 |
P-PR1264-1ml | 1ml | RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG) |
P-PR1264-25ml | 25ml | RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG) |
产品介绍：
描述：
RAPA3G Probe qPCR MasterMix 将热启动 RAPA3GDNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP 染料等试剂预混在一起，是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品不含有 ROX 校正染料，适用于各种荧光标记探针，并且适用于各种定量 PCR机型。优化的反应缓冲液，使得该制品可用于单重及多重的探针法定量 PCR。制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶，其具有最高的杂质耐受性，其对乙醇、胍盐、肝素、血清、植物多糖多酚具有极高的耐受性，因此可用于粗样品的直接定量 PCR 检测(Direct PCR)。该酶经化学法修饰，在 50℃以下 100%无活性，只有 95 度条件下加热 5min 后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩增，极大的提高了 PCR 扩增特异性。由于 RAPA3G DNA 聚合酶对 dUTP 具有极强的识别能力，该制品中的 dTTP 核酸碱基完全被 dUTP 所取代，因此扩增产物均包含 dUTP，在配合热敏 UDG（该酶在 95℃热变性 5min 后不可逆失活，不影响后续 PCR 反应）的条件下能达到最佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的测试条件下，Ct 推迟 15 个以上（污染去除能力>99.997%）。
储存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 个月。如出现白色沉淀溶解后使用，不影响反应性能。该试剂经 30 次冻融后性能无下降，因此不使用时请置于-20℃避光保存。
RAPA3G DNA 聚合酶对抑制物耐受性
SDS 0.01% Serum 2%
EtOH 5% Plasma Citrate 2%
Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%
Hematin 30μM Trizol 0.5%
操作方法：
1、按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：
终浓度
2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×
Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
其它引物和探针 X
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
60℃ 30 s 收集信号 退火/延伸
注意事项：
注意：退火延伸温度可在 55-65℃调整
3. 在多数情况下，采用两步法程序可获得理想的扩增效果，在无法达到预期理想效果的情况下，也可采用三步法 PCR程序，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
55℃ 10 s 退火
72℃ 30 s 收集信号 延伸
4. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线和标准曲线。
注意：消化污染步骤中的温度设置可在 25-37℃之间均可，无显著差异，但高于 42℃以上的温度会导致热敏 UDG 消化能力急剧下降。
pcr相关试剂实验结果分析：
PCR实验结果的分析涉及多个方面，包括实验操作、试剂质量、实验条件等，这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。以下是对PCR实验结果分析的一些关键点：
循环次数过多：增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用两种温度的PCR循环，可以有效避免循环次数过多导致的问题。
退火温度过低：退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要，过低的退火温度可能导致非特异性扩增，影响结果的准确性1。
电泳体系问题：包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、凝胶没有凝固好、琼脂糖质量差等问题，这些都会影响DNA片段的分离效果。
试剂盒问题：运输储存不当可能引起试剂盒失效，试剂盒本身质量问题如引物选择、循环参数设置不当也可能导致实验失败1。
降解的陈旧模板：使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布，影响结果的解读1。
PCR假阴性结果：可能由引物长度不够、试剂浓度不标准、靶序列突变或缺失、循环参数设置错误、标本中有Taq酶抑制剂、PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。
为了获得准确的PCR实验结果，需要注意以下几点：
确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。
在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测，以便及时对反应条件进行调整。
防止样本的污染和交叉感染，以免影响PCR反应的准确性和可靠性。
通过上述分析，可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素，从而提高实验结果的准确性和可靠性。
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