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其他参数
Equi-phi29 DNA Polymerase
商品属性:
货号 | 规格 | 产品名称 |
P-PR1290-1000U | 1000U | Equi-phi29 DNA Polymerase |
P-PR1290-10KU | 10KU | Equi-phi29 DNA Polymerase |
产品介绍:
描述:
Equi-phi29 DNA Polymerase 是 phi29 的改造体,并经多次纯化分离而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的链置换、连续合成特性(>70kb)的基础上,提高了滚环扩增的反应温度,该酶酶可以在 42 度条件下持续的进行 DNA 合成(而 phi29 DNA 聚合酶在此温度下反应活性很低)。
这种高温的反应特性,在以下几个方面对实验有明显的提升:
(1)在 NGS 测序中,其提升了高 GC 含量、回文结构等复杂模板的延伸能力,使得 NGS 的覆盖度更均一,降低测序所需深度;
(2)高温的反应条件,提升了基因组 DNA的 WGA 产物的合成量,并可以进行变温扩增;
(3)降低测序中 Gap 区域,提升单细胞测序的数据质量和完整度;
(4)降低非特异性扩增产物;
(5)提升 MDA/RCA 等实验的扩增性能和特异性。
除此外,该酶仍然具有很强的 3’→5’外切酶校读功能,合成的 DNA 片段保真性高。该酶的外切酶活性较强,因此合成过程中引物需要 3’端硫代修饰,以降低外切活性对引物的切割效应。
储存:-20℃可保存 3 年。
注意事项:
注意:在不同的实验类型中,Oligo根据实验需要自行选择。
2. 引物和模板退火:体系配制完毕后,放置到 PCR 仪中,95℃ 3min,25℃ 3min。3. 退火完毕后,向退火产物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase,混合均匀。
4. 扩增反应
4.1 恒温扩增
对于环状DNA模板采用恒温反应作为推荐使用30℃恒温扩增,30℃孵育 6~16h.该酶在 30-42℃条件下均可工作,
必要时根据实验类型进行调整。
4.2 变温扩增
对于基因组 DNA 或 cDNA 模板,推荐使用变温扩增反应,以在短时间内获得更高产量,并提高了低浓度模板的扩增产量。在 PCR 仪上做如下设置:
【30℃ 5min;42℃ 15s】循环 72 次(约 6h)或 120次(约 10h).必要时,反应结束后,可于 65°C 10min 进行失活反应。
使用注意事项
(1)必要时可单独额外添加终浓度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA,可提高反应效率。
(2)该酶的最佳反应温度为 42 ℃ (在 30~42℃之间均有活性)。
(3)65℃ 10min 即可使该酶失活。
(4)根据实验类型需要,调整dNTP的浓度100~500 μM。
(5)添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 产量。
(6)反应引物 3’端的硫代修饰可避免引物降解。
pcr相关试剂实验结果分析:
PCR实验结果的分析涉及多个方面,包括实验操作、试剂质量、实验条件等,这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。以下是对PCR实验结果分析的一些关键点:
循环次数过多:增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用两种温度的PCR循环,可以有效避免循环次数过多导致的问题。
退火温度过低:退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要,过低的退火温度可能导致非特异性扩增,影响结果的准确性1。
电泳体系问题:包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、凝胶没有凝固好、琼脂糖质量差等问题,这些都会影响DNA片段的分离效果。
试剂盒问题:运输储存不当可能引起试剂盒失效,试剂盒本身质量问题如引物选择、循环参数设置不当也可能导致实验失败1。
降解的陈旧模板:使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布,影响结果的解读1。
PCR假阴性结果:可能由引物长度不够、试剂浓度不标准、靶序列突变或缺失、循环参数设置错误、标本中有Taq酶抑制剂、PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。
为了获得准确的PCR实验结果,需要注意以下几点:
确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。
在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测,以便及时对反应条件进行调整。
防止样本的污染和交叉感染,以免影响PCR反应的准确性和可靠性。
通过上述分析,可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素,从而提高实验结果的准确性和可靠性。
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