找不到产品?留下需求帮您找
一键询价3i3i流式试剂/试剂盒
一个月以上
1000 - 1万¥
花开富贵(测试)
一个月以上
1000 - 1万¥
Waters WAT052880 AccQ-Fluor试剂盒
现货
1¥
德国WTW 光度计配套试剂
现货
面议
Super ECL Plus(超敏化学发光检测试剂盒) S6009M
一周
566¥
PAGE 彩色快速凝胶制备试剂盒(10%)
一周
375¥
Minerva Super Fusion Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)
一周
875¥
Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒
一周
516¥
FITC-Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒
一周
1244¥
Super ECL Plus(超敏化学发光检测试剂盒)
博尔森 | 一周
566¥
Minerva Super Fusion Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)
产品货号: M2026L
产品规格:10 μL× 50T
产品内容:
注:微量体积试剂请在正式实验开始前进行瞬时离心操作
储存条件:-20℃保存,有效期见外包装。
产品介绍:无缝克隆是一种简单、快速并且高效的 DNA 定向克隆技术,可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 Minerva Super Fusion Cloning Mix 通过识别 DNA 片段和线 性化载体末端的 15-25 bp 同源序列,50℃反应 15-60 min 即可将 DNA 片段和线性化载体高效精确地融合在一起, 完成定向克隆,且克隆阳性率可达 95%以上。
产品特点:
1. 简单、快速、高效,可将插入片段克隆至任意线性载体 的任意位点;
2. 不依赖于连接酶,无载体自连,阳性率可达 95%以上;
3. 无需考虑插入片段自身携带的酶切位点;
4. 一次反应可完成单至多个片段重组。
使用方法:
流程概要图:
一. 制备线性化克隆载体
选择合适的克隆位点,对载体进行线性化,线性化载体 可以通过酶切或者反向 PCR 扩增完成。
(1)酶切制备 双酶切:线性化完全,转化背景(假阳性克隆)低; 单酶切:线性化程度差,可通过适当延长酶切时间来减 少环状质粒的残留。 注:(1)双酶切无需去磷酸化,单酶切需要去磷酸化; (2)酶切完成后,应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重 组反应。 (2)反向 PCR 扩增制备 载体质粒 DNA 为模板,克隆位点为分界点,设计一对 反向引物,推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。
二. 设计插入 PCR 引物片段 PCR 引物的 5’端必须包含与其相邻片段(插入片段或 载体)末端同源的 15~25 nt(推荐 18 nt)序列。假如载体 为粘性末端,且 3’端突出,则引物设计必须包含突出部分; 若 5’端突出,则引物设计可以包含突出部分,也可以不包含。 插入片段扩增引物: 5’—上游载体末端同源序列+酶切位点(可选)+基因特 异性正向扩增序列—3’ 3’—基因特异性反向扩增序列+酶切位点(可选)+下游 载体末端同源序列—5’
注:尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆,当载体克隆 位点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为 40~60%时,重组效率最高
三. 插入片段的 PCR 扩增 插入片段可用任意 PCR 酶 (Taq 酶或高保真酶) 扩增, 无需考虑产物末端有无 A 尾 (重组过程中将被去除, 在最 终质粒中不会出现)。 建议使用高保真聚合酶进行扩增以减 少扩增突变的发生。建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝 克隆反应,若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩 增产物,可直接可用于无缝克隆反应,但加样的体积不宜超 过反应总体积的 20% 。
四.无缝克隆反应:
1. 冰水浴中配制以下反应体系:
1.最适载体用量(ng)= 0.02×载体碱基对数,即 0.03 pmol。 2 插入单片段时,最适片段用量(ng)= 0.04×片段碱基对数;插入多 片段时,每片段最适用量(ng)= 0.02×片段碱基对数。 注:(1)如果插入的单片段长度大于载体,那么应互换载体与插入片段 用量; (2)如果插入的片段长度小于 200 bp,那么要使用 5 倍载体的用量; (3)如果按上述公式计算得到的用量低于最低/高于最高值,那么建议 直接按最低/最高用量使用; (4)载体或插入片段过长,片段数量过多,均会降低阳性率。 体系配制完成后,轻轻吹吸数次混匀各组分,避免产生 气泡即可,切勿涡旋。
2. 将反应体系置于 50℃,反应 15-60 min。 注:(1)推荐使用温控比较精准的仪器进行反应,如 PCR 仪,反应时 间不足或过长都会降低克隆效率; (2)当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上时,建议延长反 应时间到 30~60 min; (3)50℃反应完成后,建议进行瞬时离心,将反应液收集至管底。 3. 将反应液离心管置于冰水浴中冷却,直接进行转化或储 存于-20℃。 注:-20℃储存的重组产物,建议在 1 周内使用。
五. 克隆产物转化 在 100 μL 感受态细胞中加入 5-10 μL 反应液,轻柔吹 吸混匀,置于冰上 30 min。42℃热激 45~60s,冰浴 5 min。 加入 500 μL SOC 或 LB 培养基,37℃振荡培养 40-60 min (200 rpm)。将菌液均匀涂布在含相应抗生素的平板上,倒 置于 37℃培养箱培养过夜。 注:(1)不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别,推 荐使用转化效率>108 cfu/μg 的感受态细胞; (2)PCR 产物与线性化载体的数量和纯度决定了菌落数; (3)阳性对照平板通常生长大量白色单菌落,阴性对照平 板只生长很少的菌落。
六. 阳性克隆检测菌落 PCR 鉴定:挑取单菌落置于 10 μL ddH2O 中混匀, 95℃裂解 10 min,取 1 μL 作模板,进行菌落 PCR 鉴定,推荐使用 UE 2×Taq PCR Master Mix(Green)(S2045)。 酶切鉴定:将单菌落接种到抗性培养基中培养过夜,提 取质粒进行酶切鉴定。
注意:(1)建议菌落 PCR 时,至少使用一条通用引物,可有效避免假 阳性结果; (2)必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定
常见问题