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硫化氢(H2S)含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
产品说明:
硫化氢(H2S)是一种新型气态信号分子,存在于脑内的神经递质,生理浓度的 H2S 对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用,并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。其在植物中也具有促进种子萌发、调节植物气孔、增强光合作用等作用,同时还会影响植物体内的氧化还原平衡和物质代谢。
H2S 与 N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝,亚甲基蓝在 665nm 处有最大吸收峰,通过测定其吸光值可计算 H2S含量。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌或培养细胞样本:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):提取液一体积(mL)=500-1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min),12000g 4℃离心 10min;然后取 0.8mL 上清液,再加入 0.15mL提取液二,12000g 4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
2. 组织样本:按照组织质量(g):提取液一体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液一),进行冰浴匀浆;12000g 4℃离心 10min;然后取 0.8mL 上清液,再加入 0.15mL 提取液二,12000g 4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清(浆)或其它液体样本:取 100μL 血清(浆)或其它液体加入 1mL 提取液一,12000g 4℃离心 10min;然后取 0.8mL 上清液,再加入 0.15mL 提取液二,12000g 4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 665nm,分光光度计用蒸馏水调零。
2. 加样表(按顺序在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)
充分混匀,室温静置 10min 后,665nm 处测定各管吸光值 A,分别记为 A 测定、A 空白,计算 ΔA=A 测定-A空白。(空白管只需做 1~2 管)
三、H2S 含量计算
1、用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线回归方程 y = 0.0026x-0.0268(其中 ΔA 为纵坐标 y,标准溶液浓为横坐标 x),将 ΔA 带入公式中得到 x(nmol/mL)。
(1)按照样本质量计算
H2S 含量(nmol/g 质量)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ (W×V 上清÷V 提取液一)=1.1875×x÷W
(2)按照细胞数量计算
H2S 含量(nmol/104 cell)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ (cells×V 上清÷V 提取液一)=1.1875×x÷cells
(3)按照液体体积计算
H2S 含量(nmol/mL)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]=13.0625×x
V 上清:提取时上清液的体积:0.8mL;V 提取液一:加入提取液一的体积:1mL;V 提取液二:加入提取液二的体积:0.15mL;V 样本:反应液中加入样本的体积,0.05mL;W:样本质量,g;cells:细胞数量,104个;V 液体:液体样本体积:0.1mL。
2、用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线回归方程 y = 0.0020x-0.0633(其中 ΔA 为纵坐标 y,标准溶液浓为横坐标 x),将 ΔA 带入公式中得到 x(nmol/mL)。
(1)按照样本质量计算
H2S 含量(nmol/g 质量)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ (W×V 上清÷V 提取液一)=1.1875×x÷W
(2)按照细胞数量计算
H2S 含量(nmol/104 cell)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ (cells×V 上清÷V 提取液一)=1.1875×x÷cells
(3)按照液体体积计算
H2S 含量(nmol/mL)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]=13.0625×x
V 上清:提取时上清液的体积:0.8mL;V 提取液一:加入提取液一的体积:1mL;V 提取液二:加入提取液二的体积:0.15mL;V 样本:反应液中加入样本的体积,0.05mL;W:样本质量,g;cells:细胞数量,104个;V 液体:液体样本体积:0.1mL。
注意事项:
1、如果 ΔA 值过低或接近空白值,建议增加样本量后再进行测定;如果 ΔA>1.2,建议稀释样本后再进行测定,计算公式中要乘以相应的稀释倍数。
实验实例:
1、 称取 0.1g 小鼠肝脏按照样本提取步骤处理,按照测定步骤操作,使用 96 孔板测定 665nm 处反应液吸光度,计算 ΔA = A 测定-A 空白=0.150-0.121=0.029,将 ΔA 代入标准方程 y = 0.0020x-0.0633,R2 = 0.9951,计算得 x;按样本质量计算得:
H2S 含量(nmol/g 质量)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ (W×V 上清÷V 提取液一)=548.03nmol/g 质量。
2、 称取 0.1g 紫叶李按照样本提取步骤处理,按照测定步骤操作,使用 96 孔板测定 665nm 处反应液吸光度,计算 ΔA = A 测定-A 空白=0.270-0.121=0.149,将 ΔA 代入标准方程 y = 0.0020x-0.0633,R2 = 0.9951,计算得 x;按样本质量计算得:
H2S 含量(nmol/g 质量)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ (W×V 上清÷V 提取液一)=1260.53nmol/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!