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Caspase-6 活性检测试剂盒说明书
比色法
规格:20T/18S、50T/48S、100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:分装-20℃保存。
2、 试剂二:分装-20℃保存。
3、 标准品:pNA 标准溶液,5 mmol/L。标准溶液在 4℃条件下为浑浊状态,溶解即可变为澄清状态,不影响使用。
4、 标准品稀释液配制:取 9 mL 试剂一加入 1 mL 试剂二,充分混匀待用。(也可按照试剂一:试剂二=9:1的比例,自行配制)。
产品说明:
Caspase 是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族,包含 10 多个成员。Caspase-6 也称 Mch-2,其前体蛋白被 granzyme B 剪切后形成活化的 caspase-6 二聚体,可诱导细胞凋亡。Caspase-6 可剪切凋亡的关键调节蛋白 PARP,剪切核膜上关键蛋白 Lamin A,其对于 Lamin A 的识别位点是 VEID。
本 试 剂 盒 测 定 原 理 基 于 Caspase-6 特 异 水 解 其 多 肽 底 物 Ac-VEID-pNA (N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-pnitroanilide),释放出游离的硝基苯胺 pNA,后者呈黄色在 405 nm 具有最大吸收峰,采用可见光光度比色法测定。其吸光度值对应于 Caspase-6 的水解活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、100μL 玻璃比色皿/96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、培养细胞:先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细胞数量(约 106个)加 100 μL 试剂二(若裂解不充分可提高至 150-200 μL),震荡重悬沉淀,置冰上静置 15 min,4℃,15000g 离心 10-15min,取上清置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):试剂二体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 试剂二),冰浴研磨或充分剪碎,置冰上静置 15 min,4℃,15000g 离心 10-15min,取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 405nm,蒸馏水调零。
2、 临用前用标准品稀释液将 5 mmol/L pNA 标准品稀释至 200、100、50、25、12.5、0μmol/L 的标准溶液待用。
3、 样本测定(在 96 孔板/EP 管中按顺序加入以下试剂)
三、Caspase-6 活性计算
1. 标准曲线的建立:
根据标准管的浓度(x,μmol/L)和 ΔA 标准(y,减去浓度为 0 的空白管)做标准方程。将 ΔA 测定代入标准方程得到 x(μmol/L)。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-6 活性增加百分比=(实验处理组 A 测定-A 空白管)/(实验对照组 A 测定-A 空白管)×100%该方法简单可靠,可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
caspase 酶活力单位的定义:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底
物饱和时,在 37℃一个小时内可以剪切 1nmol pNA 底物产生 1nmol 游离 pNA 的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的 caspase 酶活性。
Caspase-6 活性(U/mg prot)=x×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×103=2x÷Cpr÷T
V 反总:反应体系总体积,0.1mL=10-4L;V 样:加入的样本体积,0.05mL;T:反应时间,h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;103:单位换算系数,1μmol =103nmol。
注意事项:
1、由于试剂二中含有还原剂(DTT),建议将样品用水稀释 2 倍后,用 Bradford 法测定蛋白浓度,以降低 DTT对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用 BCA 法测定蛋白浓度。
2、Caspase 活性测定值低最常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少,其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时,并非剂量越大时间越长 Caspase 活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如 0、2、4、8、16、24 小时,以检测最佳的观察点。
3、所测样本的值高于标准曲线上限时,可用试剂二稀释样本后重新测定。
4、盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。37 oC 孵育,肉眼可见颜色变黄时的 OD405 值约为 0.2,此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜,但酶活性较强时,孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!