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获取电话Caspase-2 活性检测试剂盒说明书
比色法
规格：20T/18S、50T/48S、100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制：
1、 试剂一：分装-20℃保存。
2、 试剂二：分装-20℃保存。
3、 标准品：pNA 标准溶液，5 mmol/L。标准溶液在 4℃条件下为浑浊状态，溶解即可变为澄清状态，不影响使用。
4、 标准品稀释液配制：取 9 mL 试剂一加入 1 mL 试剂二，充分混匀待用。（也可按照试剂一：试剂二=9:1的比例，自行配制）。
产品说明：
Caspase 是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含 10 多个成员。Caspase-2 也称 Ich-1 或 Nedd-2，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活。Caspase-2 的 mRNA 具有两种不同剪切变体，其全长 mRNA 翻译的蛋白可促进凋亡，而短蛋白产物则可抑制凋亡。Caspase 2 可以被 Caspase-1、3 和 granzyme B 激活。
本试剂盒测定原理基于 Caspase-2 特异水解其多肽底物 N-acetyl-Val-Asp-Val-Ala-Asp-pNA (Ac-VDVADpNA)，释放出游离的硝基苯胺 pNA，后者呈黄色在 405 nm 具有最 大吸收峰，用可见光分光光度比色方法测定。
其吸光度值对应于 Caspase-2 的水解活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、100μL 玻璃比色皿/96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、培养细胞：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（约 106个）加 100μL 试剂二（若裂解不充分可提高至 150-200 μL），震荡重悬沉淀，置冰上静置 15 min，4℃，15000g 离心 10-15min，取上清置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：试剂二体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 试剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置 15 min，4℃，15000g 离心 10-15min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。
2、 临用前用标准品稀释液将 5 mmol/L pNA 标准品稀释至 200、100、50、25、12.5、0μmol/L 的标准溶液待用。
3、 样本测定（在 96 孔板/EP 管中按顺序加入以下试剂）
三、Caspase-2 活性计算
1. 标准曲线的建立：
根据标准管的浓度（x，μmol/L）和 ΔA 标准（y，减去浓度为 0 的空白管）做标准方程。将 ΔA 测定代入标准方程得到 x（μmol/L）。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-2 活性增加百分比=（实验处理组 A 测定-A 空白管）/（实验对照组 A 测定-A 空白管）×100%该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
参考 Chemicon 公司的 caspase 酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在 37℃一个小时内可以剪切 1nmol pNA 底物产生 1nmol 游离 pNA 的酶量。这样就可以计算出样本中含有多少个酶活力单位的 caspase 酶活性。
Caspase-2 活性（U/mg prot）=x×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T×103=2x÷Cpr÷T
V 反总：反应体系总体积，0.1mL=10-4L；V 样：加入的样本体积，0.05mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；103：单位换算系数，1μmol =103nmol。
注意事项：
1、由于试剂二中含有还原剂（DTT），建议将样本用水稀释 2 倍后，用 Bradford 法测定蛋白浓度，以降低 DTT对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用 BCA 法测定蛋白浓度。
2、Caspase 活性测定值低最常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长 Caspase 活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如 0、2、4、8、16、24 小时，以检测最 佳的观察点。
3、所测样本的值高于标准曲线上限时，可用试剂二稀释样本后重新测定。
4、盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。37oC 孵育，肉眼可见颜色变黄时的 OD405 值约为 0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
