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动物组织中甲醛脱氢酶(FDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 0.25 mL 蒸馏水,充分混匀;用不完的试剂-20℃分装保存两周,避免反复冻融。(1瓶粉剂溶解后可做 100T,为了延长使用时间,此产品多给 1 瓶粉剂)
2、 试剂二工作液:根据试验所需用量,按照试剂二(μL)∶蒸馏水(μL)=1∶29 比例配成工作液,现配现用。试剂二工作液当天配制当天用完。
3、 试剂三:临用前加入 0.6mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂 4℃分装保存两周。
产品说明:
甲醛脱氢酶存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中,是一种将甲醛进行转换的氧化还原酶。甲醛脱氢酶可催化甲醛和 NAD+产生 NADH,在 340nm 处的吸光值会增加,测定 340nm 处的吸光值变化,可计算得到甲醛脱氢酶的活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照动物组织质量(g):提取液体积(mL)=1∶5~10 的比例(建议称取 0.1 g 动物组织,加入 1 mL提取液),冰浴匀浆,8000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤)置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 临用前将试剂一、试剂四置于 37℃预热 10 min。
3、 在微量石英比色皿或96孔UV板中依次加入 20 μL 样本、110 μL试剂一、50 μL试剂二工作液、10 μL试剂三、10μL 试剂四,充分混匀后于 340nm 处测定 20s 时的吸光值 A1,迅速置于 37℃水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃),拿出迅速擦干测定 5min20s 时的吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。
三、动物组织中甲醛脱氢酶活性计算
A、按微量石英比色皿计算
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
FDH酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F
2、按样本质量计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
FDH酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×W÷V样总)÷T×F=321.54×ΔA÷W×F
ε:NADH 摩尔消光系数,6220 L/mmol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V反总:反应体系总体积,2×10-4L;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109 nmol;F:稀释倍数。
B、按 96 孔板(UV 板)计算将上述公式中 d=1 cm 变为 d=0.6 cm,代入公式进行计算即可。
注意事项:
1、如果测定吸光值 A>1.5 或 ΔA>0.5,建议用提取液稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数;如果测定吸光值较低,建议增加样本量后再进行测定。
2、试剂四有毒性,实验时请佩戴口罩手套等防护用具。
实验实例:
1、 称取 0.1 g 小鼠心脏组织,加入 1 mL 提取液,冰浴匀浆,8000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清置于冰上待测。使用微量石英比色皿按照测定步骤操作,计算 ΔA=A2-A1=0.6385-0.3807=0.2578,按公式计算小鼠心脏组织中甲醛脱氢酶活性:
FDH酶活(U/g 质量)=321.54×ΔA÷W×F=825.9 U/g 质量
2、 称取 0.1 g 小鼠肝脏组织,加入 1 mL 提取液,冰浴匀浆,8000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清稀释 10 倍置于冰上待测。使用微量石英比色皿按照测定步骤操作,计算 ΔA=A2-A1=0.2534-0.1699=0.0835,按公式计算小鼠肝脏组织中甲醛脱氢酶活性:
FDH酶活(U/g 质量)=321.54×ΔA÷W×F=2684.9 U/g 质量
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!