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海藻糖合成酶(TS)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前取一瓶先加入 6mL 蒸馏水,震荡使其充分溶解(若溶解后的试剂中有黑色颗粒物,可离
心后取上清使用),用不完的试剂 2-8℃保存 2 周。
2、 工作液的配制:临用前将试剂三和试剂四 1:1 等体积混合,根据样本实际所需用量现配现用。
3、 标准品:临用前加入 1 mL 蒸馏水配制成 50 μmol/mL 的麦芽糖标准溶液,用不完的试剂 2-8℃保存 2 周。
产品说明:
然后用蒸馏水八倍稀释成 6.25 μmol/mL 的麦芽糖标准溶液(建议吸取 25 μL 50μmol/mL 麦芽糖标准溶液,加入 175 μL 蒸馏水中,充分混匀)待测,现用现配。
海藻糖是功能性低聚糖,具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性,是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一,它对生物大分子和生物组织有着非特异性的保护作用。
海藻糖合成酶(Trehalose Synthase,TS)能催化麦芽糖生成海藻糖,是海藻糖生物合成的关键途径之一。本试剂盒使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖,通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量,按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合成酶的活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1 mL提取液,超声波破碎细胞(功率200W,超声3s,间隔9s,重复30次);然后8000 g,4℃,离心10 min,取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤),置于冰上待检。
组织:按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为1 : 5~10的比例(建议称取约0.1 g组织,加入1 mL提取液),进行冰浴匀浆。8000 g,4℃,离心10 min,取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤,置于冰上待检。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上,调节波长至505 nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:
(1)酶促反应(在EP管中进行以下操作):
三、酶活性计算
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS酶活(U/mg prot)= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(V样×Cpr)÷T×F×1000÷2
=26.041×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F
2、按样本质量计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS酶活(U/g 质量)= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(V样÷V样总×W)÷T×F×1000÷2
=26.041×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F
3、按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每104个细菌或细胞每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS酶活(U/104 cell)= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(V样÷V样总×cell)÷T×F×1000÷2
=26.041×ΔA测定÷ΔA标准÷cell×F
C标:标准管浓度,6.25 μmol/mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;V样:加入样本体积,0.05 mL;T:反应时间,120 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;cell:细胞或细菌总数,以万计;F:稀释倍数;1000:单位换算系数,1 μmol=1000 nmol;2:1分子麦芽糖可转化为2分子葡萄糖。
注意事项:
1、 当吸光值大于 1.5 或者 ΔA 测定大于 1 时,建议将样本稀释后测量。计算公式注意乘以稀释倍数。
实验实例:
1、 取 0.1 g 小鼠肝脏加入 1 mL 提取液进行匀浆研磨,取上清用蒸馏水稀释 2 倍后按照测定步骤操作,用 96 孔板测定后计算 ΔA 测定=A 对照-A 测定=1.177-0.536=0.641、ΔA 标准=A 标准-A 空白=1.031-0.049=0.982,按样本质量计算酶活得:
TS酶活(U/g 质量)= 26.041×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F=339.965 U/g 质量。
2、 取 0.1 g 海带加入 1 mL 提取液进行匀浆研磨,取上清按照测定步骤操作,用 96 孔板测定后计算 ΔA 测定=A对照-A 测定=1.366-0.793=0.573、ΔA 标准=A 标准-A 空白=1.031-0.049=0.982,按样本质量计算酶活得:
TS 酶活(U/g 质量)= 26.041×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W×F=151.950 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!