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肌酸含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
标准品:1 mg 一水肌酸。临用前加入 1 mL 蒸馏水,充分溶解,即 1 mg/mL 一水肌酸标准储备液。用不完的
试剂 4℃保存一个月。
产品说明:
肌酸(Creatine)是一种含氮化合物,自然存在于脊椎动物体内,能够辅助为肌肉和神经细胞提供能量。肌酸可由精氨酸(arginine)、甘氨酸(glycine)及甲硫氨酸(methionine)三种氨基酸合成,可由人体自行合成,也可以从食物中摄取。大约 95%的肌酸存在于骨骼肌中,主要存在形式为磷酸肌酸。肌酸作为一种补充剂主要通过增加肌肉质量,增强运动表现能力。肌酸也被作为神经肌肉疾病的一种治疗药被广泛研究,它可能有助于保护神经和改善细胞生物功能状态。
肌酸可在碱性条件下与联乙酰-α-萘酚发生反应,生成红色产物在 530 nm 处有吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞样本的制备:按照细胞数量(104个): 提取液一体积(mL)为 500~1000 : 1 的比例(建议 500万细胞加入 1 mL 提取液一)加入提取液一,冰浴超声波破碎细胞(功率 300W,超声 3 秒,间隔 9 秒,总时间 5min);于 4℃,12000 g 离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
2、组织样本的制备:按照质量(g): 提取液一体积(mL)为 1: 5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1mL提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于 4℃,12000 g 离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
3、血清(浆):取 100 μL 血清(浆)加入 1 mL 提取液一,4℃,12000 g 离心 10 min,取 0.8 mL 上清液,再加入 0.15 mL 提取液二,4℃,12000 g 离心 10 min 后取上清待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 530 nm,蒸馏水调零。
2、 标准溶液配制:将 1 mg/mL 一水肌酸标准储备液,用蒸馏水稀释至 100、80、50、25、12.5、6.25 μg/mL 标准溶液待用。
3、 按下表步骤加样:
注:空白管只需做 1-2 次。
三、肌酸含量计算
1、 标准曲线绘制:以一水肌酸标准溶液浓度为横坐标(x,μg/mL),以 ΔA 标准为纵坐标(y)绘制标准曲线,
得到线性回归方程 y=kx+b,将 ΔA 测定带入方程求得 x(μg/mL)。
2、 计算公式
(1)按照蛋白浓度计算
肌酸含量(μg/mg prot)= x×V 样÷(V 样×Cpr)×0.879=x÷Cpr×0.879
(2)按照样本质量计算
肌酸含量(μg/g 质量)= x×(V 上清+V 提取液二)÷(W×V 上清÷V 提取液一)×0.879=1.044×x÷W
(3)按照细菌或细胞数量计算
肌酸含量(μg/104 cell)= x×(V 上清+V 提取液二)÷(细胞数量×V 上清÷V 提取液一)×0.879
= 1.044×x÷细胞数量
(4)按照血清(浆)体积计算
肌酸含量(μg/mL)= x×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]×0.879=11.482×x
V 样:加入样本体积,100 μL=0.1 mL;V 上清:提取液一提取时上清液体积,0.8 mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;细胞或细菌数量:以 104计;V 提取液一:加入提取液一体积,1 mL;V 提取液二:加入提取液二体积,0.15 mL;V 液体:液体样本体积,0.1 mL;0.879:换算系数,一水肌酸相对分子质量 149.15,无水肌酸相对分子质量 131.13,0.879=131.13÷149.15。
注意事项:
1、显色完成后,请在 10 min 之内完成检测。
2、提取液中含有蛋白沉淀剂,提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酸含量需要另取样本,即取相同质量的组织、同等数目的细菌或细胞,用 1.1875mLPBS(生理盐水)匀浆;取相同体积的血清(浆),用 1.206mLPBS(生理盐水)匀浆(相当于提取步骤最终样本上清液),用 BCA 法进行蛋白浓度测定。
3、如果测定吸光值低于或超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
4、试剂一、试剂二对人体有刺激性,请采取适当的防护措施。为了您的安全和健康,请穿实验服并戴乳胶手套操作。
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠肌肉加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心,取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二,离心取上清稀释 2 倍后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=1.335-0.058=1.277,带入标准曲线y=0.0118x+0.0343,计算 x=105.3。按样本质量计算含量得:
肌酸含量(μg/g 质量)=1.044×x÷W ×2(稀释倍数)=2198.7 μg/g 质量。
2、 取 100μL 牛血清加入 1mL 提取液一,离心取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二,离心取上清,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.596-0.069=0.527,带入标准曲线y=0.0118x+0.0343,计算
x=41.754。按照液体体积计算含量得:
肌酸含量(μg/mL)=11.482×x= 479.4 μg/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!