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5'-核苷酸酶(5'-NT)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂五:临用前加入 4 mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂 4℃保存两周。
2、 试剂六:临用前加入 4 mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂 4℃保存两周。
3、 工作液配制:临用前取 1 支试剂一中加入到 1 瓶试剂二中充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存一周,现用现配。
4、 定磷试剂的配制:按 H2O:试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。
5、 标准品:8 mg 磷标准品。临用前加入 4.6 mL 试剂四溶解配制成 10 μmol/mL 的标准溶液,溶解后 4℃保存。
产品说明:
5'-核苷酸酶(5'-NT)是一种对底物特异性不高的水解酶,可作用于多种核苷酸。广泛存在于各种植物、动物组织、血清血浆中。5'-NT 是一种特殊的磷酸酯水解酶,它作用于核苷-5'-磷酸如 AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成无机磷酸和核苷。通过定磷显色法测定所生成的无机磷含量,可以计算出 5'-NT 的活性高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
天平、可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、低温离心机、恒温水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96 孔板、
可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照质量(g)﹕提取液体积(mL)为 1﹕5-10 的比例(建议称取约0.05 g,加入0.5 mL提取液),冰上匀浆后于4℃,15000 g 离心10 min,取上清置于冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个)﹕蒸馏水体积(mL)为500-1000﹕1 的比例(建议500万个细胞加入0.5 mL 蒸馏水),冰浴超声波破碎细胞(功率300 W,超声3 s,间隔7 s,总时间3 min);然后4℃,15000 g 离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 660 nm,蒸馏水调零。
2、 将标准品用试剂四稀释至 0.96、0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 μmol/mL 标准液。
3、 操作表(在 1.5 mL EP 管中操作)
(1) 酶促反应
(2) 显色反应
三、5'-NT 活性计算
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y= kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(μmol/mL)。
2、 5'-NT 活性的计算
(1)按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
5'-NT 酶活(U/mg prot)=x×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr
(2)按样本质量计算
酶活单位定义:每克组织在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活单位。
5'-NT 酶活(U/g 质量)=x×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×103=166.67×x÷W
(3)按细胞数计算:
酶活单位定义:每 104 个细胞在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
5'-NT酶活(U/104 cell)=x×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T×103=166.67×x÷细胞数量
(4)按液体体积计算:
酶活单位定义:每毫升液体在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
5'-NT酶活(U/mL)=x×V反总÷V样÷T×103=333.3×x
V样:酶促反应中加入样本体积,0.02 mL;V反总:酶促反应总体积,0.2 mL;V样总:加入提取液的体积,0.5mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;细胞数量:以万计;T:酶促反应时间,30 min;103:单位换算,1 μmol=103 nmol。
注意事项:
1. ΔA 测定大于 1 或者 A 测定管大于 1 时,建议将样本用试剂四稀释后再进行测定。
实验实例:
1、取 0.1g 小鼠肝,进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定管=A 测定-A 对照=0.449-0.334=0.115,带入标准曲线 y=1.5514x+0.0038,计算 x=0.0717,按照样本质量计算酶活得:
5'-NT 酶活(U/g 质量)=333.3×x÷W=333.3×0.0717÷0.1=238.98 U/g 质量。
2、取0.1g稗草,进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.245-0.196=0.049,带入标准曲线 y=1.5514x+0.0038,计算 x=0.0291,按照样本质量计算酶活得:
5'-NT 酶活(U/g 质量)=333.3×x÷W=333.3×0.0291÷0.1=97.00 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!