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顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
试剂三:易挥发试剂,使用后尽快拧紧盖子放入-20℃保存。
产品说明:
顺乌头酸酶(Aconitase, ACO)是细胞内一种重要的铁硫蛋白酶,主要存在于胞浆与线粒体中。ACO 催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆反应,对维持三羧酸循环及乙醛酸循环的顺利进行起着重要作用。
顺乌头酸酶催化异柠檬酸生成顺乌头酸,顺乌头酸在 240nm 有特征吸收峰,通过检测顺乌头酸的产生速率来计算该酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、顺乌头酸酶的提取:(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
A、总顺乌头酸酶的提取:
称取约 0.1g 组织或收集 500 万个细胞(细菌),加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三,用匀浆器或研钵于冰上匀浆。将匀浆置于冰上超声波破碎(功率 40%,超声 3 秒,间隔 9 秒,重复 15 次),4℃,11000×g 离心 15min,取上清置于冰上待测(若以蛋白浓度计算,则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr1)。用于测定总顺乌头酸酶活性(建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测)。
B、胞浆与线粒体中顺乌头酸酶的提取:
(1) 称取约 0.2 g 组织或收集 1000 万个细胞,加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三,用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
(2) 4℃,600×g 离心 5min。(若以蛋白浓度计算,则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr2)。
(3) 将上清液移至另一离心管中,4℃,11000×g 离心 15min。
(4) 上清液即胞浆提取物,用于测定胞浆中的顺乌头酸酶活性(建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测)。
(5) 在沉淀中加入 400μL 试剂二与 4μL 试剂三,置于冰上超声波破碎(功率 40%,超声 3 秒,间隔 9 秒,重复 15次),4℃,5000×g 离心 2min,取上清置于冰上待测。用于测定线粒体中顺乌头酸酶活性(建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测)。
注意:根据实验需要选择性提取细胞总顺乌头酸酶、胞浆乌头酸酶或线粒体乌头酸酶。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至240nm,蒸馏水调零。
2. 样本测定
(1) 工作液的配制:临用前将试剂五和试剂六加入到试剂四中,充分溶解待用,用不完的试剂 4℃避光保存;
(2) 将工作液 25℃预热 15min 以上;
(3) 在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入:
三、顺乌头酸酶活性的计算
A、按微量石英比色皿计算:
1、总顺乌头酸酶活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N
(2) 按样本质量计算
酶活定义:每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×W)÷T×N=561.11×ΔA÷W×N
(3) 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×细胞数量(万个))÷T×N
=561.11×ΔA÷细胞数量(万个)×N
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:顺乌头酸消光系数,3.6 L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 提取:样本总体积,1.01mL;T:反应时间,5min;Cpr1:样本蛋白质浓度,mg/mL;106:单位换算系数,1mmol=1×106nmol;N:稀释倍数。
2、胞浆顺乌头酸酶活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N
(2) 按样本质量计算
酶活定义:每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×W)÷T×N=561.11×ΔA÷W×N
(3) 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 提取×细胞数量(万个))÷T×N
=561.11×ΔA÷细胞数量(万个)×N
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:顺乌头酸消光系数,3.6L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 提取:胞浆样本总体积,1.01mL;T:反应时间,5min;Cpr2:样本蛋白质浓度,mg/mL;106:单位换算系数,1mmol=1×106nmol;N:稀释倍数。
3、线粒体顺乌头酸酶活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N
(2)按样本质量计算
酶活定义:每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×W)÷T×N=244.44×ΔA÷W×N
(3) 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1 nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×106]÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个)÷T×N
=244.44×ΔA÷细胞数量(万个)×N
V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:顺乌头酸消光系数,3.6 L/mmol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:线粒体样本总体积,0.404mL;T:反应时间,5min;Cpr2:样本蛋白质浓度,mg/mL;106:单位换算系数,1mmol=1×106nmol;N:稀释倍数。
B、按 96 孔 UV 板计算:
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。
注意事项:
1、 A 大于 1 时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,并在计算时乘以相应的稀释倍数。
2、 当 ΔA 小于 0.01 时,可适当延长反应时间,并在计算时将实际反应时间(T)带入计算公式。
3、 测定蛋白浓度时,由于试剂一本身含有蛋白(约 1 mg/mL)所有测定时需要扣除此部分蛋白。
实验实例:
1. 取 0.1g 画眉草样本,加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三进行总顺乌头酸酶的提取,取上清稀释 4 倍,用微量石英比色皿测得 ΔA=A2-A1=0.5693-0.5571=0.0122,按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得:
ACO 酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=273.8217 U/g 质量。
2. 取 0.1g 兔子肾脏样本,加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三进行总顺乌头酸酶的提取,取上清稀释 8 倍,用微量石英比色皿测得 ΔA=A2-A1=0.4520-0.4186=0.0334,按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得:
ACO 酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=1499.2859 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!