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吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
规格: 50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂三:临用前加入 2.5 mL 蒸馏水溶解,现配现用,-20℃分装保存,-20℃保存一周;
2、试剂四:临用前每瓶加入 3 mL 蒸馏水溶解,现配现用,-20℃分装保存,-20℃保存一周。
产品说明:
在干旱、盐渍化、重金属、紫外线等不同的胁迫条件下,均会诱导植物体内脯氨酸的积累,对植物起到保护作用。高等植物中,脯氨酸的合成有两条途径,分别以谷氨酸和鸟氨酸为前体。谷氨酸途径主要负责胁迫条件下脯氨酸的积累,而鸟氨酸途径主要在氮充足条件下起作用,与胁迫情况下脯氨酸的积累没有关系。1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶,P5CS 是一个双功能酶,在 NADPH和 ATP 作用下,可催化谷氨酸磷酸化及谷氨酸 γ-半醛还原,通过测定 NADPH 在 340 nm 处吸光度的变化,可计算出 P5CS 的活性高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1 mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织样本:按质量(g)︰提取液体积(mL)1︰5~10 比例(建议称取 0.1 g 样本,加入 1.0 mL 提取液一)加入提取液一,再加入 10 μL 提取液二,冰浴匀浆后于 4℃,8000 rpm,离心 15 min,弃沉淀,取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂三、试剂四置于冰上待测。
3、 操作表:(在 1 mL 石英比色皿中操作)
三、P5CS 酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADPH 为一个酶活单位。
P5CS 酶活(U/mg prot)=ΔA÷ε÷d×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADPH 为一个酶活单位。
P5CS 酶活(U/g 质量)= ΔA÷ε÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T =324.76×ΔA÷W
ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V 反总:反应体系总体积,0.001L;Cpr:
样本蛋白浓度,mg/mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1.01 mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5 min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、当 A1 测定高于 1.2 或者 ΔA 大于 0.5 时,建议将样本稀释后检测,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、尽量使用新鲜样本进行检测,操作时请置于冰上操作。
3、ΔA 空白管的数值一般不超过 0.05。
实验实例:
1、取 0.1g 三叶草进行样本处理,样本稀释 2 倍,按照测定步骤操作,计算得 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=0.923-0.895=0.028,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.667-0.659=0.008,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.02,按照样本质量计算酶活得:
P5CS 酶活(U/g 质量)=324.76×ΔA÷W×稀释倍数=129.9 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!