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获取电话亚铁氧化酶（HP）活性检测试剂盒说明书
微量法
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制：
1、试剂三：临用前加入 6 mL 蒸馏水溶解备用，用不完的试剂 4℃保存；2-8℃保存 4 周。
2、标准品：9 μmol/mL 的亚铁离子标准液。
产品说明：
亚铁氧化酶（Hsphasetin，HP）是铜蓝蛋白的同系物，催化亚铁离子（Fe2+）氧化为三价铁离子（Fe3+），从 而三价铁与转铁蛋白结合，参与细胞铁释放。
以一定浓度的Fe2+为底物，在亚铁氧化酶的催化作用下Fe2+被氧化为Fe3+，Fe2+与菲咯嗪形成有色复合物， 在 562 nm 处有特征吸收峰，先计算出未被氧化的Fe2+的含量，进而得出被氧化的Fe2+的含量，可通过Fe2+被氧 化的速率来反映亚铁氧化酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照质量（g）︰蒸馏水体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g，加入 1 mL 蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于 10000 rpm，4℃离心 10 min，取上清置于冰上待测。
2、血清或血浆：建议用蒸馏水将血清或血浆稀释 2~4 倍后直接检测。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 562 nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：将9μmol/mL的亚铁离子标准液用蒸馏水倍比稀释为360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL
的标准溶液备用。
3、 标准液稀释可参考下表：
备注：实验中每个标准管需 40μL 标准溶液。
4、 操作表：在 1.5 mL 离心管（分光光度计）或 96 孔板中依次加入下列试剂：
三、亚铁氧化酶活性计算
1、 标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度（nmol/mL）为 x 轴，其对应的ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y= kx+b，将ΔA 测定带入方程得到样本浓度（x，nmol/mL）。
2、 亚铁氧化酶活性的计算：
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活定义：每 mg 蛋白每分钟氧化 1 nmol 的Fe2+定义为 1 个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V 试剂二÷（V 样×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N
（2）按照样本质量计算
酶活定义：每 g 样品每分钟氧化 1 nmol 的Fe2+定义为 1 个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活（U/g 鲜重）= x×V 试剂二÷（V 样×W÷V 提取）÷T×N = 1.667x÷W×N
（3）按液体体积计算
酶活定义：每 mL 样本每分钟氧化 1 nmol 的Fe2+定义为 1 个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活（U/mL）= x×V 试剂二÷V 样÷T×N = 1.667x×N
V 试剂二：加入的试剂二体积，0.04 mL；V 样：加入的样本体积，0.008 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：3 min；N：稀释倍数。
注意事项：
1. 当 A 测定低于 0.1 时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。
实验实例：
1、 取 0.1g 结肠，进行样本处理，按照测定操作步骤，测得计算ΔA 测定 =（A 无基质管-A 空白管）-（A 测定管-A 对照管）=（1.144-0.041）-（1.114-0.048）=0.037，带入标准曲线 y = 0.0031x - 0.0007，计算 x=11.710，按照样本质量计算酶活得：
亚铁氧化酶酶活（U/g 质量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×11.710÷0.1=195.161 U/g 质量。
2、 取兔血清，按照测定操作步骤，测得计算ΔA 测定=（A 无基质管-A 空白管）（- A 测定管-A 对照管）=（0.577-0.048）-（1.114-0.048）=0.574，带入标准曲线 y = 0.0031x - 0.0007，计算 x=184.935，按照液体体积计算酶活得：
亚铁氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×184.935=308.287 U/mL
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
