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莽草酸脱氢酶(SD)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
规格: 50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:内含不溶物,用前摇匀。
2、 试剂二:临用前加入 10 mL 蒸馏水溶解。
3、 试剂三:临用前每瓶加入 11 mL 蒸馏水溶解。
4、 工作液的配制:根据用量按照试剂一:试剂二:试剂三为 7:4:8 的体积比例充分混匀,现用现配,用前 25℃预热 15min。
产品说明:
莽草酸途径是存在于植物和微生物中的一条重要的代谢途径,莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代谢途径中催化第四步反应的关键酶。
莽草酸脱氢酶催化莽草酸和NADP产生NADPH,检测340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液(加入前摇匀))进行冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
2、细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3、液体:直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂:
三、SD酶活计算
注意事项:
1. 样本提取上清液置于冰上待测,且样本提取完成后建议2h内测完。
2. 样本的蛋白浓度需自行测定,由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
3. ΔA大于1时,建议将样本稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时,可以延长反应时间(10min或15min)来测定。
4. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。
实验实例:
1. 取0.1g萝卜叶,加入1mL提取液,进行样本处理,取上清按照测得步骤操作,测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=1.441-1.201=0.24,ΔA空白管=A2空白-A1空白=0,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.24,按照样本质量计算得:
SD酶活(U/g 质量)=643×ΔA÷W=1543.2 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!