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脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;
2、 试剂三:临用前加入 4 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;
3、 试剂四:临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂可分装-20℃保存,避免反复冻融。
4、 工作液的配制:首先将试剂三和试剂四配成溶液,临用前根据用量按照试剂一(V):试剂二(V):试剂三(V)=1.6(mL):0.2(mL):0.15(mL)的比例充分混匀。(注意:现配现用,用多少配多少)
产品说明:
ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。
ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸,脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸(PMS)传递还原2,6-二氯酚靛酚(DCPIP),并且在600nm处具有特征吸收峰,通过600nm吸光度的下降,测定2,6-DCPIP的还原速度,代表ProDH活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、匀浆器/研钵、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL提取液一),进行冰浴匀浆,1500g 4℃离心 15min,取上清液于一支新的 EP 管中,加入 10μL 提取液二,涡旋混匀,冰浴放置 30min 后,15000g 4℃离心 20min,取上清置冰上待测。
2、细胞或细菌:按照细胞数量(104个):提取液一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液一),冰浴匀浆,1500g 4℃离心 15min,取上清液于一支新的 EP 管中,加入 10μL 提取液二,涡旋混匀,冰浴放置 30min 后,15000g 4℃离心 20min,取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,波长调至600nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 工作液置于 37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴 5min。
3、 加样表(在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入下列试剂)
三、ProDH酶活计算
注意事项:
1. ΔA大于0.6时或者A3大于1.5时建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。
2. 控制A3在0.8以上(96孔板在0.4以上),若A3小于0.8(用96孔板数值小于0.4时),建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。
3. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.02。
实验实例:
1、 取 0.1g 稗草加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨,对样本进行处理,取上清稀释 2 倍,之后按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定=A3-A4=0.8549-0.4798=0.3751,ΔA 空白=A1-A2=0.8941-0.8813=0.0128,ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.3751-0.0128=0.3623,按样本质量计算酶活得:
ProDH(U/g 质量)=333.33×ΔA÷W×稀释倍数=333.33×0.3623÷0.1×2=2415.309 U/g 质量。
2、 取 0.1g 兔子肾脏组织加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨,对样本进行处理,取上清后按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定=A3-A4=0.9369-0.6631=0.2738,ΔA 空白=A1-A2=0.8941-0.8813=0.0128,ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白=0.2738-0.0128=0.261,按样本质量计算酶活得:
ProDH(U/g 质量)=333.33×ΔA÷W=333.33×0.261÷0.1=869.99 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!