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吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前加入 5 mL 蒸馏水备用,2-8℃保存两周。
2、 试剂二:临用前取 1 瓶加入 3 mL 蒸馏水备用,2-8℃保存一周(1 瓶粉剂溶解后可做 100T,为了延长使用时间,此产品多给 1 瓶粉剂)。
3、 试剂三:临用前加入 5.71 mL 50%乙醇(乙醇(V):H2O(V)=1:1)溶解备用。可以-20℃分装保存两周,避免反复冻融。
4、 试剂五:临用前加入 15 mL 试剂四溶解备用,2-8℃保存两周。
5、 标准品:10 mg 吲哚乙酸。临用前加入 1.14 mL 50%乙醇(乙醇(V):H2O(V)=1:1)溶解制成 50 μmol/mL的标准溶液,-20℃分装保存两周,避免反复冻融。
产品说明:
吲哚乙酸(IAA)在吲哚乙酸氧化酶的作用下,被氧化破坏失去活性。IAA氧化酶能调节植物体内吲哚乙酸的的水平,从而影响植物的生长。
IAA在无机酸条件下与FeCl3作用生成红色产物,在530nm下有最 大吸收峰。酶活力的大小可用消耗IAA的速率表示。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。12000g,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至530nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释:将标准溶液用蒸馏水稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 μmol/mL的标准液。
3、 标准液稀释可参考下表:
4、 加样表:
三、吲哚乙酸氧化酶酶活计算
注意事项:
1、当ΔA大于0.4或者A对照管大于1时,建议将样本用提取液稀释后进行测定;ΔA过小时,可增加酶促反应时间(1h或2h)或增加加入的样本体积来测定。注意同步修改计算公式。
2、试剂一溶解变黑后则不能使用;试剂二有毒性,做好防护措施。
实验实例:
1. 取 0.1g 红豆加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算ΔA 测定=A 对照-A 测定=0.477-0.402=0.075,带入标曲 y=2.7049x-0.0154,得出 x=0.0334,按样本质量计算酶活得:
IAA 酶活(U/g 质量)=333×x÷W=333×0.0334÷0.1=111.22 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!