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获取电话果糖-1.6-二磷酸醛缩酶（FBA）活性检测试剂盒说明书
微量法
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入 2 mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2、 试剂三：临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3、 试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-分装后 20℃保存，禁止反复冻融；
4、 试剂五：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
产品说明：
果糖 1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase，FBA）（EC4.1.2.13）是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与 calvin 循环的重要酶，催化果糖 1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和 3-磷酸甘油醛，广泛存在于动植物及微生物体内，在各种逆境胁迫下表现不同的响应。
果糖 1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在磷酸丙糖异构酶和 α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和 α-磷酸甘油，340nm 处吸光值的变化可反映果糖 1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
①总 FBA 酶：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液一）充分冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液一），冰浴超声波破碎细菌或细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
液体：直接检测。
②胞浆和叶绿体 FBA 酶的分离：
（1） 按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），手工快速研磨或匀浆，之后于 4℃，200g 离心 5min；
（2） 弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min（离心时缓慢加速和降速）；
（3） 取上清用于测定胞浆 FBA 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，上清即为叶绿体中 FBA 酶活性。
建议测定总FBA酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的FBA，则按照步骤②提取粗酶液。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定：(在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂)
三、FBA 酶活计算
注意事项：
1、若 ΔA 大于 0.8 建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、若是植物样本，建议在提取完成后 2h 内检测完，如果样本量过大，建议分批提取、检测。
3、由于提取液一中含有一定浓度的蛋白（约 0.5mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例：
1、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清稀释 8 倍后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测 得 计 算 ΔA 测 定 管 =A1 测 定 -A2 测 定 =1.3061-1.125=0.1811， ΔA 空 白 管 =A1 空 白 -A2 空 白 =1.1983-1.1858=0.0125，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1811-0.0125=0.1686，按样本质量计算酶活：
FBA 酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×8（稀释倍数）= 321.54×0.1686÷0.1×8（稀释倍数）=4337 U/g 质量。
2、 取 0.1g 绿萝加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算 ΔA测定管=A1 测定-A2 测定=1.4458-1.37=0.0758，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=1.1983-1.1858=0.0125，ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.0758-0.0125=0.0633，按样本质量计算酶活：
FBA 酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W=321.54×0.0633÷0.1=204 U/g 质量。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
