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乙醇酸氧化酶(GO)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 2.5 mL 双蒸水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
产品说明:
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是乙醇酸循环中的一种酶,也是植物光呼吸代谢中的关键酶,催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,通过测定乙醇酸氧化酶活性,可以了解植物光合和呼吸代谢的基本方法。
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在 324nm 有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板UV板、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测。细胞或细菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL
提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至324nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。
2. 将试剂一25℃预热15min。
3. 样本测定:在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂:
三、GO 酶活计算
注意事项:
1、 测定之前进行预实验,若吸光值 A1>1,请将样本用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、 色素含量较高的样本,可在提取酶时加活性炭吸附。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,其 OD 值变化不超过 0.02。
实验实例:
1. 称取约 0.1g 三叶草组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清进行检测,使用微量石英比色皿测得 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定=0.8956-0.7839=0.1117,ΔA 空白管=A2 空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1117-0.0083=0.1034,按样本质量计算酶活得:GO 酶活(U/g 质量)=392.16×ΔA÷W=405.4934 U/g 质量。
2. 称取约 0.1g 菠菜组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清稀释 2 倍进行检测,使用微量石英比色皿测得 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定=0.9286-0.8105=0.1181,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0.0853-0.077=0.0083,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1181-0.0083=0.1098,按样本质量计算酶活得:
GO 酶活(U/g 质量)=392.16×ΔA÷W×2(稀释倍数)=861.1834 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!