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获取电话线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒说明书
微量法
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液配制：
1. 试剂二：临用前每支加入 1.11 mL 双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存，避免反复冻融；
2. 试剂四：临用前加入 3 mL 双蒸水，充分混匀；
3. 试剂五：临用前加入 8 mL 双蒸水，充分混匀；
4. 试剂六：临用前加入 8 mL 双蒸水，充分混匀；
5. 标准品：10 μmol/mL 磷标液，临用前用蒸馏水稀释 40 倍即 0.25 μmol/mL 磷标准液。
6. 定磷试剂的配制：按 H2O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最 好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
产品说明：
线粒体复合体Ⅴ又称 F1F0-ATP 合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由 F1和 F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化 ATP 合成，也可逆过程水解 ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成 ATP 的关键酶。
复合体Ⅴ水解 ATP 产生 ADP 和 Pi，通过测定 Pi 增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 4 ℃ 600g 离心 10min。
3. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g 离心 15min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
5. 在沉淀中加入 600μL 试剂一，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 12 次），用于复合体Ⅴ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1．可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2．样本测定：
三、复合体Ⅴ活性计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA 测定÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷（Cpr×V 样本）÷T
=20×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
C 标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；V 样本：样本体积，0.05mL；V 酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。
注意事项：
1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于 1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。
2. 由于提取液中含有蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。
3. 测定胞浆时，定磷后反应液可能会有絮凝产生，测定前混合均匀即可，并不影响测定结果。
4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
5. 本试剂盒试剂足够完成 100 管反应。
6. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为 100T/24S）
A、上清中复合体Ⅴ活力的计算：
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA1÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷(W÷V 提取×V 样本)）÷T
=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W
ΔA1：上清测定值；C 标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V 提取：
加入提取液体积，1.0mL；V 样本：样本体积，0.05mL；V 酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。
B、沉淀中复合体Ⅴ活力的计算：
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA2÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷(W÷V 提取×V 样本)）÷T
=12×ΔA2÷ΔA 标准÷W
ΔA2：沉淀测定值；C 标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V 提取：
沉淀重悬体积，0.6mL；V 样本：样本体积，0.05mL；V 酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。
C、样本复合体Ⅴ总活力的计算：
样本复合体Ⅴ总活力即为上清中复合体Ⅴ活力与沉淀中复合体Ⅴ活力之和。
按样本质量计算：复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W+12×ΔA2÷ΔA 标准÷W
实验实例：
1. 取 0.1g 兔子肾脏进行样本处理，上清液和沉淀都稀释 4 倍后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得 ΔA 标准=A标准管-A 空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的 ΔA1=A 测定管-A 对照管=0.679-0.119=0.560，沉淀的 ΔA2=A测定管-A 对照管=0.773-0.052=0.721，则按样本质量计算得：
上清中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W×4（稀释倍数）=1349.4 U/g 质量
沉淀中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=12×ΔA2÷ΔA 标准÷W×4（稀释倍数）=1042.4 U/g 质量
复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W×4+12×ΔA2÷ΔA 标准÷W×4=2391.8 U/g 质量。
2. 取 0.1g 冬青进行样本处理，上清液和沉淀都稀释 2 倍后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得 ΔA 标准=A 标准管-A 空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的 ΔA1= A 测定管-A 对照管=0.535-0.320=0.215，沉淀的 ΔA2=A 测定管-A 对照管=0.357-0.089=0.268，则按样本质量计算得：
上清中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W×2（稀释倍数）=259.04 U/g 质量
沉淀中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=12×ΔA2÷ΔA 标准÷W×2（稀释倍数）=193.73 U/g 质量
复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W×2+12×ΔA2÷ΔA 标准÷W×2=452.77 U/g 质量。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
