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Ca++Mg++-ATP 酶活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂三:临用前取 1 支加入 1 mL 蒸馏水充分混匀待用;现用现配。用不完的试剂-20℃分装保存一周。
2、 试剂六:临用时加入 5 mL 蒸馏水,溶解后 2-8℃保存两周。
3、 试剂七:临用时加入 5 mL 蒸馏水,溶解后 2-8℃保存两周。
4、 标准品:10mmol/L 标准磷贮备液。将标准品 20 倍稀释,即取 0.1 mL 标准品加 1.9 mL 蒸馏水充分混匀,配成 0.5 μmol/mL 标准磷应用液,现用现配。
5、 定磷剂的配制:按 H2O:试剂六:试剂七:试剂八=2:1:1:1 比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂根据样本量现用现配。
注意:配试剂最 好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
产品说明:
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/
匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一,超声波破碎细菌或细胞(功率 200w,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至660nm,可见分光光度计需用蒸馏水调零。
2、 酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
3、 定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)
注意事项:
1、 由于每一个样都必须做对照,本试剂盒 100 管只能测 48 份 Ca++Mg++-ATP 酶。
2、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
实验实例:
1、 取 0.1g 胰腺加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清置冰上,按照测定步骤操作,使用 96孔板测得 ΔA 测定=0.535-0.238=0.297,ΔA 标准=0.280-0.043=0.237,按样本质量计算酶活得:
Ca++Mg++-ATP 酶活力(U/g 质量) =7.5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=93.99 U/g 质量。
2、 取 0.1g 柳树加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清置冰上,按照测定步骤操作,使用 96孔板测得 ΔA 测定=0.105-0.099=0.006,ΔA 标准=0.280-0.043=0.237,按样本质量计算酶活得:
Ca++Mg++-ATP 酶活力(U/g 质量) =7.5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=1.90 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!