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线粒体复合体Ⅳ活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
工作液的配制:临用前取试剂一、试剂二、试剂三,将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解。
产品说明:
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞色素C的氧化,并最终把电子传递给氧生成水。还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C,因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1.0 mL 提取液,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4 ℃ 600g 离心 10min。
2. 将上清液移至另一离心管中,4 ℃ 11000g 离心 15min。
3. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4. 在沉淀中加入 400uL 提取液,超声波破碎(功率 20%,超声 5 秒,间隔 10 秒,重复 15 次),用于复合体Ⅳ酶活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。
2、 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育15min;用不完的试剂4℃可保存一周;
3、 样本测定(在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入)
立即混匀,分别记录测定管和空白管 550nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,测定管的记为 A1 测定管,A2 测定管,空白管的记为 A1 空白管,A2 空白管。计算 ΔA1=A1 测定管-A2 测定管,ΔA2=A1 空白管-A2空白管,ΔA=ΔA1-ΔA2。
三、复合体Ⅳ活力单位的计算
注意事项:
实验实例:
1、 取 0.1g 兔肝脏进行样本处理,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿 ΔA2=A1 空白管-A2 空白管=0.7713-0.7669=0.0044,上清液的 ΔA1=A1 测定管-A2 测定管=0.7985-0.7754=0.0231,ΔA 上清=ΔA1-ΔA2=0.0231-0.0044=0.0187,沉淀中的 ΔA1=A1 测定管-A2 测定管=0.8843-0.7415=0.1428,ΔA 沉淀=ΔA1-ΔA2=0.1428-0..0044=0.1384,按样本质量计算:
上清液中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=1099×ΔA 上清÷W=1099×0.0187÷0.1=205.513 U/g 质量
沉淀中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=440×ΔA 沉淀÷W=440×0.1384÷0.1 =608.96 U/g 质量
则样本复合体Ⅳ总活力(U/g 质量)=1099×ΔA 上清÷W+440×ΔA 沉淀÷W
=1099×0.0187÷0.1+440×0.1384÷0.1=814.473 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!