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获取电话丙酮酸激酶（PK）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前在试剂二瓶中加入 17mL 试剂一和 1mL 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴 5 分钟，现配现用；
2、 试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为 17:1000 的体积比例充分混匀，冰上放置备用，现用现配。
产品说明：
PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最 后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 细菌或培养细胞：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）提取液体积（mL）为 500-1000：1的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或者 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2. 组织：
按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3. 血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定：
在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三和 180μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm处 20s 时的吸光值A1和 2min 20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
三、PK 活性计算
注意事项：
1．测定过程中试剂三、样本在冰上放置，以免变性和失活。
2．比色皿中反应液的温度尽量保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。或酶标板放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）恒温培养箱中孵育。
3．最 好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
