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谷胱甘肽 S-转移酶(GST)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液配制:
试剂三:临用前加 2 mL 蒸馏水溶解。
产品说明:
GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族,主要存在于细胞质内。GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分,主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合,使亲电化合物变为亲水物质,易于从胆汁或尿液中排泄,达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此,GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外,因为 GST 具有 GSH-Px 活性,亦称为 non-Se GSH-Px,具有修复氧化破坏的大分子如 DNA、蛋白质等的功能。注意,GST 催化的反应减少 GSH 含量,但是不增加 GSSG 含量。GST 催化 GSH 与 CDNB 结合,其结合产物的光吸收峰波长为 340nm;通过测定 340nm 波长处吸光度上升速率,即可计算出 GST 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
自备仪器和用品:
低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外-可见分光光度计/酶标仪、研钵/匀浆器、微量石英比色皿/96 孔 UV板和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3 . 血清等液体:直接测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 340nm,用蒸馏水调零。
2. 试剂二放在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)保温。
3. 空白管:取微量石英比色皿,加入 20μL 试剂一,180μL 试剂二和 20μL 试剂三,迅速混匀后于 340nm 测定 10s吸光度记 A1,在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴 5min 后,快速取出测定吸光度记 A2。
4. 测定管:取微量石英比色皿,加入 20μL 上清液,180μL 试剂二和 20μL 试剂三,迅速混匀后于 340nm 测定 10s吸光度记 A3,25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴 5min 后,快速取出测定吸光度记 A4。
三、GST 活性计算
注意事项:
1. 样本处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;
2. 细胞中 GST 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GST 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞;
3. 若样本测定吸光度大于 1,建议对样本用蒸馏水稀释,计算时结果乘以稀释倍数;
4. 测定反映的温度对测定结果有影响,请控制在 25℃或者 37℃(哺乳动物)。
实验实例:
1、 取 0.1g 月季加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清,稀释 50 倍置冰上待测,按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A4-A3=0.7046-0.62=0.0846,ΔA 空白管=A -A1=0.5902-0.5207=0.0695,按样本质量计算得:
GST(U/g 质量)=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W×50(稀释倍数)= 1.737 U/g 质量。
2、 取 0.1g 肺加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清,稀释 50 倍置冰上待测,按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A4-A3=0.9402-0.5059=0.4343,ΔA 空白管=A2-A1=0.5902-0.5207=0.0695,按样本质量计算得:
GST(U/g 质量)=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W×50(稀释倍数)=41.952 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!