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获取电话抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加 10 mL 蒸馏水充分溶解。4℃可以保存 1 周。（由于试剂稳定性较差，故多给一瓶）
2、 试剂三：临用前根据样本量取适量试剂三用蒸馏水稀释 100 倍使用即可。
产品说明：
APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化 H2O2氧化 AsA，是植物 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到 AsA 的含量，APX 与 AsA 具有一定的负相关性。 APX 催化 H2O2氧化 AsA，通过测定 AsA 氧化速率，来计算得 APX 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、低温离心机、移液枪、水浴锅、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃中预热 30min 以上。
3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中加入 20μL 蒸馏水、140μL 预热的试剂一、20μL 试剂二和 20μL试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 的吸光度 A1 和 A2，ΔA 空白管=A1-A2。
4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中加入 20μL 上清液、140μL 预热的试剂一、20μL 试剂二和 20μL试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 的吸光度 A3 和 A4，ΔA 测定管=A3-A4。
三、APX 活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/mg prot) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T
=1.79×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：每克样本每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/g 质量) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=1.79×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷W
ε：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：加入试剂一体积，1mL；T：催化反应时间，2min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/mg prot) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T=3×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：每克样本每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/g 质量) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=3×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷W
ε：AsA 在 290m 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.6cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：加入试剂一体积，1mL；T：催化反应时间，2min。
实验实例：
1、 取 0.1g 小蓟样本加入 1mL 试剂一进行匀浆研磨，取上清，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 空白管=A1-A2=0.5453-0.5287=0.0166，ΔA 测定管=A3-A4=0.7097-0.6137=0.096，按样本质量计算酶活得：APX（U/g 质量）=1.79×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷W=1.79×（0.096-0.0166）÷0.1=1.421 U/g 质量。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
