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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 35 mL 试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
2、 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 1:120 稀释,现用现配。
3、 试剂四:液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 7:250 稀释,现用现配。
4、 试剂五:粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解;可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
5、 工作液的配制:将试剂二、试剂三、试剂四按 7:1:1(V:V:V)的比例配制工作液,工作液现用现配。
产品说明:
PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的第 一限速酶。
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清,置冰上待测。
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。
3、 操作表:在1mL石英比色皿中依次加入下列试剂:
三、PEPCK酶活计算
注意事项:
1、 当 A1 小于 1 或 ΔA 大于 0.6 时,建议将样本稀释适当倍数后再进行测定,以提高检测灵敏度。
2、 酶活性高的样本如动物肝、肾等组织,建议将样本用提取液稀释 5 倍或 5 倍以上测定。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.06。
4、 加样、混匀等步骤要迅速,秒表计时要准确,如果条件允许建议由两人配合完成本测定试验。
实验实例:
1、 取 0.1g 肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后再用提取液稀释 10 倍,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=1.175-0.532=0.643,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=1.29-1.244=0.046,ΔA=ΔA
测定管-ΔA 空白管=0.643-0.046=0.597,按样本质量计算酶活得:
PEPCK 酶活(U/g 质量)= 3215.4×△A÷W×10(稀释倍数)=3215.4×0.597÷0.1×10=191959.4 U/g 质量。
2、 取 0.1g 芦荟加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2测定=1.257-1.106=0.151,ΔA 空白管= A1 空白-A2 空白=1.29-1.244=0.046,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.151-0.046=0.105,按样本质量计算酶活得:
PEPCK 酶活(U/g 质量)= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.105÷0.1=3376.17 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!