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中性木聚糖酶(NEX)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
标准品:10mg木糖。临用前加入667μL蒸馏水配成100μmol/mL的标准品溶液,再用水稀释50倍得到2μmol/mL的木糖标准液,备用。
产品说明:
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生,能催化水解木聚糖,也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶,可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖,降低酿造中物料的粘度,促进有效物质的释放,以及降低饲料中的非淀粉多糖,促进营养物质的吸收利用,因而广泛的应用于酿造和饲料工业中,中性木聚糖酶(NEX)一般分离自最适生长 pH 为 6-8 的微生物。
NEX 在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖,在沸水浴条件下进一步与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应,在 540nm 处有特征吸收峰,反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,通过测定反应液在 540nm吸光值增加速率,可计算 NEX 活力。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
低温离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细胞或微生物样本发酵液的制备:发酵液于 8000rpm,4℃,离心 15min,取上清,置于冰上待测。
2、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 缓冲液,冰上充分研磨。8000g,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
3、酶干粉:称约 1mg,加缓冲液 1mL,震荡充分溶解。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min 以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 将上清液/酶溶液用蒸馏水稀释十倍后置冰上待测。
3、 样本测定:
三、NEX计算公式
1. 发酵液 NEX 活力计算:
酶活定义:50℃,pH6.0 条件下每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(U/mL)=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ]÷T=0.067×ΔA 测定÷ΔA 标准
2. 酶干粉 NEX 活力计算:
酶活定义:50℃,pH6.0 条件下,每毫克酶每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(U/mg)=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ] ×V 样本×10÷(V 样本×W 酶÷V 提取)÷T
=0.67×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W 酶
3. 组织中 NEX 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:50℃,pH6.0 条件下,每 mg 组织蛋白每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(U/mg prot)=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ] ×V 样本×10÷(V 样本×Cpr)÷T
=0.67×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
(2)按样本质量计算:
酶活定义:50℃,pH6.0 条件下,每 g 组织每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力(U/g 质量)=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ] ×V 样本×10÷(V 样本×W÷V 提取) ÷T
=0.67×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
C 标准:木糖标准溶液,2μmol/mL;V 样本:加入的样本体积,0.2mL;W 酶:酶干粉的质量,mg;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:组织样本质量,g;V 提取:提取液体积,1mL;10:样本稀释倍数。
注意事项:
吸光度变化应该控制在 0.01~1.5 之间,否则加大样本量或稀释样本,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变;也可以延长或者缩短反应时间。
实验实例:
1、 取 0.1g 柳树叶加入 1mL 缓冲液进行匀浆研磨,取上清用蒸馏水稀释十倍后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA测定=A 测定管-A 对照管=1.246-0.973=0.273,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管=0.905-0.238=0.667,按样本质量计
算酶活得:
NEX 活力(U/g 质量)=0.67×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=0.67×0.273÷0.667÷0.1=2.742 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!