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获取电话β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制：
1、试剂一：临用前取 1 瓶加入 2.67mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融。
2、标准品：5μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品说明：
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。
β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2、标准溶液的稀释：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。
3、 标准液稀释可参考下表：
充分混匀，于400nm 处测定吸光值A，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2次。
三、β-GAL活性计算
1、标准曲线的建立：
根据标准管的吸光度（x，ΔA标准）和浓度（y，nmol/mL）建立标准曲线，将ΔA（x，ΔA测定）带入标准曲线中，计算样本生成的产物量y（nmol/mL）。
2、β-GAL活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg 组织蛋白每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(U/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20×y÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g 组织每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(U/g 质量)＝(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20×y÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(U/104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.04×y
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需要另外测定；V 反总：反应体系总体积，0.5mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，0.5h。
注意事项：
提取液中含有使蛋白变性的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
