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α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂一:临用前取 1 瓶加入 10 mL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂-20℃保存 4 周,避免反复冻融。
2、标准品:5 μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品说明:
α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化水解芳基或烃基与糖基之间的α-糖苷键生成葡萄糖,不仅与细胞壁的松弛或加固有关,而且与细胞识别和一些信号分子产生密切相关。
α-GC分解对-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GC活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀
浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 1000 万细菌或细胞加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),15000g,4℃,离心 20min,取上清,置冰上待测。
2、组织的处理:称取约 0.2g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心 20min,取上清,置冰上待测。
3、液体样本:直接检测。若溶液有浑浊需离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长400nm,蒸馏水调零。
2、 标准溶液的稀释:将 5μmol/mL 的标准液用蒸馏水稀释成 100、50、25、12.5、6.25、0 nmol/mL 标准溶液待测。
3、 标准液稀释可参考下表:
三、α-GC活力计算
1、标准曲线建立:
根据标准管的浓度(x,nmol/mL)和吸光度(y,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA(y,ΔA测定)代入公式计算样本产物浓度x(nmol/mL)。
2、α-GC活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GC活力(U/mg prot)=(x×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr
(2)按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GC活力(U/g 质量)=(x×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20x÷W
(3)按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α- GC活力(U/104 cell)=(x×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.02x
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度需要另外测定;V反总:反应体系总体积,1mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;1000:细胞或细菌总数,1000万;T:反应时间,0.5h。
注意事项:
提取液中含有使蛋白变性的成分,故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!