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脂蛋白酯酶(LPL)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
产品说明:
脂蛋白酯酶(Lipoproteinlipase,LPL)是甘油三酯降解的降速酶,可催化甘油三酯水解为脂肪酸和单酸甘油酯,主要在肝脏实质细胞中合成,在脂质代谢和转运中发挥重要作用。脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕榈酸酯产生4-硝基苯酚,在400nm有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰、丙酮和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、 将5μmol/mL标准液用试剂一稀释16倍至0.3125μmol/mL的标准溶液备用。
3、 操作表:在1.5mL EP管中进行下列操作:
三、LPL活性计算
1、血清(浆)LPL活力计算
单位定义:在45℃,pH7.5条件下,每毫升血清每分钟水解产生1nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL(U/mL)=ΔA÷(ΔA标准÷C标准)÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA标准
2、组织、细菌或细胞中LPL活力计算
(1)按样本质量计算
单位定义:在45℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟水解产生1nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL(U/g 质量)=ΔA÷(ΔA标准÷C标准)×V提取÷W÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA标准÷W
(2)按样本蛋白浓度计算
单位定义:在45℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL(U/mg prot)=ΔA÷(ΔA标准÷C标准)×V提取÷(V提取×Cpr)÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA标准÷Cpr
(3)按细菌或细胞数量计算:
单位定义:在45℃,pH7.5条件下,每104个细胞每分钟水解产生1nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。
LPL(U/104 cell)=ΔA÷(ΔA标准÷C标准)×V提取÷500÷T×1000=0.0625×ΔA÷ΔA标准
C标准:标准溶液浓度,0.3125μmol/mL;V提取:加入试剂一体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;1000:单位换算系数,1μmol=1000nmol。
注意事项:
1、 测定管加入试剂二后混变浑浊为正常现象。
2、 若A大于1,将粗酶液用试剂一稀释后再进行测定。
实验实例:
1、 取0.1g大鼠肌肉加入1mL试剂一,取上清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA=A测定管- A对照管=0.697-0.160=0.537,ΔA标准=A标准管-A空白管=0.545-0.001=0.544,按样本质量计算酶活得:
LPL(U/g 质量)= 31.25×ΔA÷ΔA标准÷W=31.25×0.537÷0.544÷0.1=308.48 U/g 质量。
2、 取兔血清稀释2倍后按照测定步骤操作,测得计算ΔA=A测定管- A对照管=0.639-0.096=0.543,ΔA标准=A标准管-A空白管=0.545-0.001=0.544,按血清(浆)体积计算酶活得:
LPL(U/mL)= 31.25×ΔA÷ΔA标准×2(稀释倍数)=31.25×0.543÷0.544×2(稀释倍数)=62.39 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!