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β-淀粉酶(β-AL)活性检测试剂盒说明书(DNS 显色法)
可见分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:若有黄色晶体析出,需加热溶解后再用;
2、 试剂二:临用前取 1 支试剂三加入到 1 瓶试剂二中,置于常温水中并加热至煮沸,期间不断搅拌粉剂至溶解,用不完的试剂 2-8℃保存 4 周;
3、 标准品:10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水配制成 10 mg/mL 的标准溶液,2-8℃保存两周。
产品说明:
淀粉酶负责水解淀粉,主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。
还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸,β-淀粉酶不耐热。根据上述特性,钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称取约 0.1g 样本,加入 0.8mL 蒸馏水,研磨匀浆;将匀浆倒入离心管中,提取液在室温下放置提取 15min,每 5min 振荡 1 次,使其充分提取;6000g,常温离心 10min,取上清液加蒸馏水定容至 10mL,摇匀,即淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液 1mL,加入 4mL 蒸馏水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2. 标准液的稀释:将10mg/mL葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液。
3. 标准液稀释可参考下表:
备注:实验中每个标准管需 250μL 标准溶液。
4. 取2支EP管分别加入250μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液,沸水浴5min,分别作为α-淀粉酶对照管和总淀粉酶对照管使用。
5. 按操作表依次加入各试剂:
三、酶活性计算
1. 标准曲线的绘制:
以标准液的浓度(mg/mL)为x轴,对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔAα代入方程得到x1(mg/mL),ΔA总代入方程得到x2(mg/mL)。
2. α-淀粉酶活性:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/g 质量)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T =2×x1÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α-淀粉酶活性(U/mg prot)=x1×V样÷(V样×Cpr)÷T=0.2×x1÷Cpr
3. 总淀粉酶活性计算:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性 (U/g 质量)=5×x2×V样÷(W×V样÷V样总) ÷T=10×x2÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×x2×V样÷(V样×Cpr)÷T=x2÷Cpr
4. β-淀粉酶活性计算:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/g 质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(10×x2÷W)-(2×x1÷W)=(10×x2-2×x1)÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(x2÷Cpr)-(0.2×x1÷Cpr)
5:总淀粉酶稀释倍数,(4mL+1mL)/1mL=5;V样:加入反应体系中样本体积,0.25mL;V样总:提取液总体积,10mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。
注意事项:
测定的吸光值大于1时,可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小,可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!