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总胆固醇(TC)含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:自备异丙醇,4℃保存。
2、 标准品:10 mg 胆固醇,临用前加入 517 μL 提取液,振荡溶解,即为 50 μmol/mL 的胆固醇标准溶液。
3、 试剂三:液体置于试剂瓶内 EP 管中。
4、 工作液的配制:将试剂一:试剂二:试剂三按 3 mL:20 μL:3 μL 的比例配制工作液,现用现配。
产品说明:
总胆固醇(Total Cholesterol,TC)是指所有脂蛋白所含胆固醇的总和,包括游离胆固醇和胆固醇酯。利用酯酶催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇(FC)和游离脂肪酸(FFA),从而把胆固醇酯转化为FC;进一步利用胆固醇氧化酶催化FC氧化,生成4-胆甾烯酮和H2O2;最 后利用过氧化物酶催化 H2O2氧化4-氨基安替比林和酚,生成红色醌类化合物,其在500nm有特征吸收峰,其颜色深浅与TC含量成正比。
技术指标:
最 低检出限:0.056 μmol/mL
线性范围:0.078-2 μmol/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、天平、低温台式离心机、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、EP管、蒸馏水、异丙醇。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。10000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
2、细菌、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 2 秒,间隔 3 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
3.血清(浆)样本:直接测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至500nm,蒸馏水调零。
2. 将50μmol/mL标准液用提取液稀释为2、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL的标准溶液备用。
3. 操作表:(在1.5ml离心管中依次加入下列试剂)
三、总胆固醇含量计算
1. 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。
2. 总胆固醇含量的计算:
(1)按血清(浆)体积计算:TC含量(μmol/dL)=x×100
(2)按样本蛋白浓度计算:TC含量(μmol/mg prot)=x×V提取÷(Cpr×V提取)=x÷Cpr
(3)按样本质量计算:TC含量(μmol/g 质量)=x×V提取÷W=x÷W
(4)按细胞、细菌数量计算:TC含量(μmol/104 cell)=x×V提取÷500=0.002x
100:单位换算系数,1dL=100mL;V提取:加入样本的提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
注意事项:
1、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
2、 用提取液提取后的上清不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白浓度,需另取组织。
实验实例:
1、 取鸡血浆样本,直接按照测定步骤操作,测得计算 ΔA=A 测定管-A 空白管=0.083-0.012=0.071,根据标准曲线 y
=0.6686x-0.035,计算 x=0.1585,按血清(浆)体积计算得:
TC 含量(μmol/dL)=x×100=0.1585×100=15.85 μmol/dL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!