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游离胆固醇(FC)含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:自备异丙醇;
2、 标准品:10 mg 胆固醇,临用前加入 517 μL 异丙醇,振荡溶解,即为 50 μmol/mL 的胆固醇标准溶液,再将其用异丙醇稀释为 1 μmol/mL 的标准液,待测。
产品说明:
FC是构成细胞膜的主要成分,也是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料。FC浓度可作为脂代谢的指标。测定原理:FC氧化酶催化FC生成4-胆甾烯酮和H2O2,过氧化物酶催化H2O2、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物,在500nm有吸收峰,其颜色深浅与FC含量成正比。
技术指标:
最 低检出限:0.055 μmol/mL
线性范围:0.0625-4 μmol/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、异丙醇、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声2秒,间隔3秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清(浆)样本:直接测定。
二、测定步骤
1. 可见分光光度计预热30min以上,调节波长至500nm,蒸馏水调零。
2. 按需取出一定量的工作液,并在37℃水浴中预热30min,其余的4℃保存。
3. 样本测定:1.5mL离心管中加入下列试剂:
混匀,室温静置 15min 后于 500nm 下测吸光度,记为 A 空白管、A 标准管、A 测定管。(空白管和标准管分别只需做 1-2 个)
三、计算公式
1. 血清(浆)中 FC 含量计算:
FC 含量(μmol/dL)=C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)×100
=100×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)
C 标准液:标准液的浓度,1μmol/mL;100:单位换算系数,1dL=100mL。
2. 组织中 FC 含量计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
FC 含量(μmol/mg prot)=C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 样总÷(Cpr×V 样总)
=(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
(2) 按样本质量计算
FC 含量(μmol/g 质量)=C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 样总÷W
=(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
C 标准液:标准液的浓度,1μmol/mL;V 样总:加入提取液的体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
3. 细胞、细菌中 FC 含量计算
FC 含量(μmol/104
cell)=C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 样总÷500
=0.002×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)
C 标准液:标准液的浓度,1μmol/mL;500:细菌或细胞数量,500 万;V 样总:加入提取液的体积,1mL。
注意事项:
如果样本吸光值大于 1.5,建议将样本用提取液稀释后进行测定。
实验实例:
1. 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,测得 A 空白管=0.006、A 标
准管=0.348、A 测定管=0.188,按样本质量计算含量得:
FC 含量(μmol/g 质量)=(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W =5.322 μmol/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!