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谷丙转氨酶(GPT/ALT)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:同时提供两个 8 mL 棕瓶;临用前取一支试剂一倒入一个空瓶中,用 4 mL 蒸馏水溶解,再用溶液将试剂一残留试剂润洗下来;
2、 标准液:20 μmol/mL 丙酮酸钠溶液。
产品说明:
谷丙转氨酶又叫丙氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.2),广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化氨基酸和酮酸转氨基反应,在氨基酸代谢中具有重要作用。此外,哺乳动物肝细胞GPT活性很高,当肝细胞坏死,GPT释放到血液中,血清GPT活性显著增高。因此,GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应,生成丙酮酸和谷氨酸;加入2,4-二硝基苯肼溶液,不仅终止上述反应,而且与酮酸中的羰基加成,生成丙酮酸苯腙;苯腙在碱性条件下呈红棕色,可以在505nm读取吸光值并计算酶活力。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或微生物样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。3500g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。3500g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
2、标准曲线的稀释:首先将标准品用蒸馏水稀释至2μmol/mL,按下表混合标准品和试剂一得到浓度梯度标准管:
3、在 EP 管中加入下列试剂
注:0μmol/mL 标准管为空白管。
三、GPT 活性计算
1. 标准曲线的绘制:
以各标准溶液浓度为x轴,以?A(A标准管-A空白管)为y轴做标准曲线,得到方程y=kx+b。将(A测定管-A对照管)带入方程求x值(μmol/mL)。
2. GPT活性计算:
(1)按样本质量计算:
单位定义:每小时每g样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/g 质量)=x×(V样本+V试剂一)÷(W×V样本÷V样总)÷T=12x÷W
(2)按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每小时每mg组织蛋白催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/mg prot)=x×(V样本+V试剂一)÷(Cpr×V样本)÷T=12x÷Cpr
(3)按血清体积计算:
单位定义:每小时每mL血清样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/mL)=x×(V样本+V试剂一)÷V样本÷T=12x
(4)按细胞或细菌数量计算:
单位定义:每小时每104个细胞或细菌催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GPT活力单位。
GPT(U/104 cell)=x×(V样本+V试剂一)÷(500×V样本÷V样总)÷T=0.024x
V样本:样本体积,0.02mL;V试剂一:试剂一体积,0.1mL;V样总:提取液体积,1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;T:反应时间,0.5h;500:细胞或细菌总数,500万。
实验实例:
1、 取 0.1g 兔子肝脏组织加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后再按照测定步骤操作,测得 A 测定管=1.181,A 对照管=0.458,计算?A =A 测定管-A 对照管=1.181-0.458=0.723,带入标准曲线 y=0.5286x+0.0362,计算 x=(0.723-0.0362)÷0.5286=1.299,按样本质量计算酶活得:
GPT(U/g 质量)=12x÷W=12×1.299÷0.1=155.88 U/g 质量。
2、 取兔血清直接检测,测得 A 测定管=0.514,A 对照管=0.383,计算?A=A 测定管-A 对照管=0.514-0.383=0.131,带入标准曲线 y=0.5286x+0.0362,x=(0.131-0.0362)÷0.5286=0.179,按血清(浆)体积计算酶活得:
GPT(U/mL)=12x=12×0.179=2.148 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!